Регистрация / Вход
Прислать материал

14.578.21.0010

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.578.21.0010
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский технологический университет "МИСиС"
Название доклада
Разработка комплектов мембранных носителей для транспортировки (хранения) биологического материала и технологии их использования в ветеринарной лабораторной диагностике и эколого-эпизоотологическом мониторинге.
Докладчик
Kondakov Sergey
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Проект направлен на разработку новой отечественной системы пробоподготовки, хранения и транспортировки образцов биологических жидкостей (кровь, сыворотка крови, моча и т.д.) млекопитающих и домашних животных и птиц, основанной на получении сухих образцов биоматериала, включенных в специальные мембранные носители, для последующего проведения различных видов анализа в специализированных лабораториях.
Актуальные задачи и научно-практические проблемы, решаемые в ходе выполнения работы:
- Разработка макетов комплектов мембранных носителей (МКМН) для получения сухих пятен биологических жидкостей и проведения различных видов лабораторных анализов, используемых в ветеринарной диагностике
- Создание научно-технических и технологических основ получения и использования МКМН для проведения высокоэффективной пробоподготовки биообразцов в различных видах лабораторного анализа на основе сухих пятен биологических жидкостей для целей ветеринарной диагностики:
- Разработка научно-методических подходов и методик проведения анализа биологических жидкостей с использованием МКМН в виде сухих пятен на пористых мембранных носителях в различных видах анализа (ПЦР, ИФА и др.) на основе стандартных наборов реагентов (тест-систем) для целей ветеринарной диагностики.
Актуальность и новизна исследования
Работы по использованию технологии сухих пятен крови в ветеринарной диагностике начали проводиться за рубежом сравнительно недавно, при этом в качестве матрицы, также как и в неонатальном скрининге и медицинской диагностике, используются мембраны на основе целлюлозных носителей. В работе нами были предложен новый высокопористый мембранный носитель и новый формат пробоподготовки для получения сухих пятен крови или других биологических жидкостей, основанный на использовании специальных функционализированных гидрофильных пористых мембранных материалов на основе стекловолокна в виде узких полосок (шириной 0,5 см) мембранного носителя с нанесенными на них на одинаковом расстоянии 0,5 см линейными метками. Предложенные запатентованные решения являются уникальными и обладаютт существенными преимуществами по сравнению с зарубежными аналогами. В нашей стране такие исследования не проводились.
Описание исследования

Процесс отбора биологических проб животных и птиц и транспортировка их в диагностические ветеринарные лаборатории для последующего проведения различных видов лабораторного анализа является одной из основных и самых трудоемких стадий всего процесса лабораторной диагностики. Это обусловлено наличием ряда объективных трудностей и прежде всего касается процесса отбора проб биологических жидкостей в полевых условиях. Во-первых, в полевых условиях у большого количества животных трудно отобрать кровь в необходимом количестве с соблюдением обязательных правил отбора крови. Во-вторых, для пересылки получаемых жидких образцов в лабораторию во многих случаях необходимо использовать специальные условия транспортировки, в том числе соблюдение условий "холодовой цепи" или заморозки образцов, так анализируемые компоненты биологических жидкостей содержат в своем составе анализируемые биологически активные вещества, которые часто являются нестабильными и в процессе доставки в лабораторию и меняют состав или свои физико-химические свойства. Так, многие белки денатурируют под действием даже сравнительно невысоких температур вследствие необратимых конформационных изменений структуры белковой молекулы, а также возможного окисления или модификации отдельных функциональных групп. входящих в структуру молекул, что также приводит к изменению их физико-химических свойств, оказывающих влияние на результаты проводимых анализов.

Предлагаемый в настоящей работе с использованием технологии сухих пятен крови метод переноса жидких образцов на специально разработанные и изготовленные макеты комплектов мембранных носителей (МКМН) и последующее их высушивание, приводит к значительному упрощению и удешевлению способа доставки анализируемых образцов в диагностическую лабораторию, а также значительному повышению стабильности компонентов. находящихся в иммобилизованном (сухом) на мембранных носителях виде. Для получения пробы крови или другой биологической жидкости конец пористой мембранной полоски рабочей карточки помещают в исследуемую жидкость, которая вследствие наличия капиллярных сил начинает распространять вдоль полоски пористой гидрофильной мембраны на определенное заданное расстояние. Скорость распространений исследуемой жидкости вдоль пористого носителя и расстояние распространения зависит от вида используемых мнмбранных носителей и их физико-химических характеристик, таких как размер пор носителя, гидрофильность материала и др. Далее полоску высушивают на воздухе в течение часа при комнатной температуре, рабочую карточку помещают в герметичный пластиковый пакет с осушителем и в таком виде транспортируют в диагностическую лабораторию. Для проведения анализа достаточно с помощью обычных ножниц отделить кусочек мембранного носителя (размером 0,5  х  0,5 см), экстрагировать компоненты сухого пятна в раствор и выполнить анализ любым из стандартных методов.

Подробное изучение физико-химических и механических свойств широкого спектра коммерчески доступных мембранных носителей  позволило использовать в качестве активной части МКМН взамен широко применяемой для аналогичных целей за рубежом стандартной целлюлозной фильтровальной бумаги Whatman 903, обладающей рядом существенных недостатков, специальным образом модифицированного с целью придания необходимых физико-химических и потребительских свойств гидрофилизированного пористого мембранного  материала на основе стекловолокна. Ранее для целей получения сухих пятен крови в технологии DBS данный вид мембранных носителей никогда не использовался. Выбор в качестве основы данного класса пористого мембранного материала для использования в составе МКМН был обусловлен следующими обстоятельствами: низкая стоимость и коммерческая доступность, так как данный материал широко используется во всем мире в качестве составной части аналитических устройств для иммунохроматографического анализа (в качестве мембраны для конъюгата наночастиц золота с антителами); высокая степень стандартизации мембранного материала, обладающего фиксированным объемом внутренних пор на единицу площади мембраны; полным отсутствием необратимого адсорбционного связывания компонентов биожидкости со структурой носителя и, как следствие,  практически полным переносом компонентов биологических жидкостей при их перерастворении из сухого состояния и перевода в водную фазу.

 

Результаты исследования

Созданы новые высокоэффективные форматы и системы  пористых  мембранных    носителей для получения сухих образцов биологических жидкостей; разработаны новые виды стандартизованных пористых мембранных  носителей, обладающих специальными   свойствами; подготовлена техническая документация для создания опытных промышленных образцов макетов комплектов мембранных носителей (МКМН); определены условия получения проб различных биологических жидкостей на   мембранах в виде сухих пятен; осуществлена стабилизация высушенных образцов с целью их последующей транспортировки   и анализа в лаборатории с сохранением  функциональных свойств;  разработка высокоэффективных схем и реактивного обеспечения получения   жидких образцов путем смыва соответствующих биопроб для последующего  проведения анализа; проведена апробация новой системы пробоподготовки для стандартных наборов реагентов  для проведения анализа, в том числе с  использованием ИФА, ПЦР, РТГА и др.; разработаны методики проведения лабораторных испытаний МКМН  при   практической апробации систем пробоподготовки в реальных условиях  сельскохозяйственного производства.

На основании подробного изучения сорбционных и других физико-химических свойств мембранных носителей разработаны проекты методик получения различных видов биоматериалов в виде сухих пятен с использованием МКМН для хранения и транспортировки получаемых образцов с сохранением их функциональных свойств при последующем проведении различных видов анализа (ИФА, ПЦР и др. виды анализа). Была продемонстрирована возможность проведения иммуноферментного и других видов анализа с использованием технологии получения сухих пятен крови и других биологических жидкостей.  Разработаны методики проведения отбора биоматериала, содержащего биологически активные компоненты различной структуры и возбудителей инфекционных заболеваний в виде нативных жидких образцов и в сухом виде с использованием соответствующих МКМН. Разработаны методики изучения стабильности  биологических жидкостей, содержащих различные типы антигенов и возбудителей инфекционных заболеваний, полученных в сухом виде на основе МКМН в зависимости от времени и условий.  Показано увеличение стабильности некоторых белковых антигенов при повышенных температурах при использовании высушенных на мембранных носителях биологических жидкостей. Результаты проведенных экспериментов оформлены в виде соответствующих протоколов испытаний.

Проведены исследования по применению разработанной технологии получения сухих образцов различных биологических жидкостей животных и птиц для отбора проб и их транспортировки с целью последующего проведения различных типов лабораторного анализа.  Разработаны программы и методики проведения полевых испытаний МКМН и проведена их апробация для отработки сбора соответствующего материала в реальных практических полевых условиях или условиях содержания животных в животноводческих хояйствах и птицефабриках. Для реализаци поставленных задач был организован и проведен сбор соответствующих видов биологического материала в реальных условиях содержания животных, получены сухие образцы биологических жидкостей с использованием разработанных МКМН, транспортированы полученные в реальных условиях образцы в специализированные лаборатории, проведены соответствующие анализы и сравнение получаемых результатов со стандартными методиками, используемыми для этих целей в настоящее время.

Практическая значимость исследования
Разработанные и изготовленные МКМН и соответствующие методики их использования для получения сухих образцов биологических жидкостей различных животных и птиц были апробированы на практике при проведении массового эпизоотологического мониторинга в нескольких районах РФ. Разработанные совместно с индустриальным партнером ВНИИЗЖ (г.Владимир) Методические рекомендации были представлены в МСХ РФ для утверждения и широкого практического распространения при проведении специальных мероприятий по эпизоотологическому мониторингу.