14.607.21.0094

Диагностика и профилактика дегенеративных заболеваний мозга представляют собой чрезвычайно актуальную проблему современной неврологии. Нейродегенерации представлены сотнями нозологических форм, в абсолютном большинстве случаев обладающими прогрессирующим течением, приводящим к тяжелой инвалидизации и смерти пациентов, являясь, таким образом, важной медико-социальной проблемой.
В развитии нейродегенеративных заболеваний большую роль играют генетические факторы, выявление которых является ключом к ранней диагностике и своевременному назначению терапии.
При наличии внушительного генетического разнообразия заболеваний нервной системы молекулярно-генетическая диагностика уже не может, как это было ранее, базироваться на простом последовательном скрининге доступных для анализа генов – в этом случае поиск мутаций может оказаться слишком длительным и необоснованно дорогостоящим процессом. В настоящее время принципиальным является создание специальных диагностических алгоритмов, базирующихся на современных молекулярно-генетических технологиях, позволяющих значительно сузить рамки поиска молекулярного дефекта, и сделать такой поиск разумным с точки зрения трудозатрат и экономической целесообразности.
В задачи нашего исследования входило проанализировать генетическую структуру дегенеративных заболеваний мозга в российской популяции, которая до настоящего времени комплексно не определена, с помощью разработанных нами диагностических продуктов, основанных на современных молекулярных технологиях и методах, с целью создания наиболее рациональных с медицинской и экономической точки зрения алгоритмов диагностики социально значимых нейродегенеративных заболеваний.

ДНК-тестирование при нейродегенеративных заболеваниях представляет большие трудности в связи с их генетической гетерогенностью и необходимостью длительного поиска мутаций в десятках генов, что в ряде случаев практически невыполнимо. Ситуация драматически изменилась в последние годы в связи с появлением новейших высокопроизводительных молекулярно-генетических технологий и, в первую очередь – секвенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing, NGS). NGS позволяет за один рабочий цикл генерировать миллиарды нуклеотидных последовательностей, что обеспечивает параллельный анализ сотен выбранных генов или даже тотальное секвенирование всего генома.
Разработка диагностических продуктов с использованием последних геномных технологий, позволяет проводить научные исследования на качественно новом уровне, оценивать распространенность и значимость различных мутаций, выявлять новые гены и мутации, ассоциированные с заболеваниями и позволяющие открывать новые патогенетические механизмы заболеваний, а, следовательно, новые пути терапевтического воздействия. При этом выявление индивидуальных молекулярно-генетических вариаций является основой персонализированной медицины – неотъемлемого направления развития современной медицины. Кроме того, разработанные нами диагностические продукты позволят проводить доклиническую диагностику в семьях, отягощенных носительством мутаций, что критически важно для курабельных заболеваний (например, болезней обмена), при которых становится возможным своевременное начало необходимого лечения.

При выполнении проекта нами было обследованно 192 пациента страдающих спорадической и семейной формами болезни Паркинсона (БП), 96 пациентов с атипичным паркинсонизмом и лобно-височной дегенерацией, 105 пациентов с эссенциальным тремором и 291 человек без двигательных расстройств. Для апробации разработанной нами «диагностической  панели  основанной на геномных технологиях нового поколения, для ранней и доклинической диагностики и профилактики социально значимых дегенеративных заболеваний мозга» была сформирована группа из 32 пациентов наблюдавшихся в ФГБНУ «Научный центр неврологии». В группу исследования вошли пациенты с различной нейродегенеративной патологией, у которых не были определены мутации с помощью других (традиционных) молекулярно-генетических методов. При включении пациентов в первую выборку учитывались следующие аспекты: 1) фенотип с крайне выраженной генетической гетерогенностью (например, атаксия дегенеративного генеза); 2) фенотип, который не укладывался в типичные клинические формы нейродегенеративной патологии (т.е. имевший определенные особенности или сочетавший в себе несколько синдромов); 3) фенотип, подразумевающий конкретные гены, которые при этом являются либо достаточно протяженными для рутинной диагностики, либо редкими (т.е. с неразработанными молекулярно-генетическими протоколами исследования); 4) предпочтение отдавалось семейным случаям – для последующего сравнительного анализа пробанда и его здоровых/больных родственников.

Образцы геномной ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови с помощью коммерческих наборов выделения геномной ДНК.

Для образцов ДНК пациентов с БП были проведены ДНК-исследования:

- методом мультиплексной пробо-зависимой лигазной реакции с амплификацией (MLPA) определение встречаемости мутаций в генах SNCA, PARK2, PINK1, DJ-1, LRRK2, АТР13А2 (коммерческий набор);

- методом секвенирования по Сэнгеру, определение встречаемости мутаций и полиморфизмов в гене GBA (собственные разработки);

- методом фрагментного анализа определение встречаемости экспансий тандемных микросателлитных повторов в генах SNCA, ATXN2, ATXN3, FMR1 и C9orf72 (собственные разработки).

Для образцов ДНК пациентов с атипичным паркинсонизмом и  лобно-височной дегенерацией были проведены ДНК-исследования:

- методом секвенирования по Сэнгеру, определение встречаемости мутаций и полиморфизмов в генах MAPT и GRN (собственные разработки).

Для образцов ДНК пациентов с эсенциальным тремором были проведены ДНК-исследования:

- методом секвенирования по Сэнгеру, определение встречаемости мутаций и полиморфизмов в генах LINGO1 и LINGO2  (собственные разработки);

- методом полимеразной цепной реакции в "режиме реального времени" полиморфизмы в генах LINGO1, LINGO2 и SLC1A2 (собственные разработки).

Таргетное секвенирование на основе NGS проводили на базе Центра коллективного пользования «Биотехнология» ФГБНУ ВНИИСБ. Фрагментацию образцов ДНК проводили методом ультразвукового воздействия с использованием системы фрагментации Covaris S220 System, на фрагменты со средним размером 180-220 bp. Библиотеки готовили с использованием набора KAPA Library Preparation Kit (Roche, Швейцария). Обогащение библиотеки ДНК проводили по технологии SeqCap EZ Library SR с помощью специфических биотинилированных олигонуклеотидных зондов, комплементарных последовательностям кодирующих областей генов, входящих в нашу панель. Секвенирование полученных библиотек ДНК проводили на секвенаторе MiSeq (Illumina), с использованием набора реагентов для секвенирования MiSeq® Reagent Kit v3, 150 циклов. Последовательности адаптеров, нуклеотиды с качеством ниже q20, N-нуклеотиды были удалены из полученных прочтений с помощью программного обеспечения Trimmomatic 0.33. Последовательности картировали на геном человека (GRCh38) с использованием программного обеспечения Bowtie2; в среднем 98% прочтений были картированы успешно. Поиск вариантов осуществляли с помощью программы GATK 3.1, а их аннотацию – с помощью он-лайн ресурса wANNOVAR. При оценке патогенности выявленных вариантов использовали следующие базы данных: Human Gene Mutation Database (http://www.hgmd.cf.ac.uk ); dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp); OMIM (http://www.omim.org/); ClinVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/).

Все положительные находки подтверждались методом капиллярного секвенирования на генетическом анализаторе НАНОФОР 05 (Санкт-Петербург). Ближайшие родственники пробандов, в случае доступности, также обследовались на наличие найденных мутаций.

В результате проведенных мутационных скринингов по различным генам, ассоциированным с нейродегенеративными заболеваниями проведены обобщения по соответствующим нозологиям в российской популяции.

Так, в рамках данной работы, было проведено исследование большинства генов, ассоциированных с болезнью Паркинсона (БП). Встречаемость значимых мутаций и полиморфизмов в российской популяции, полученным по нашим данным, представлена в обобщающей таблице: 

Мутации и полиморфизмы	БП
Мутации GBA	17,7%
Делеции/дупликации PRKN	3,3%
Мажорная мутация LRRK2	4,4%
Делеции/дупликации PINK	0,5%
Полиморфизм 263 SNCA-Rep1	7,2%
Промежуточная экспансия FMR1	16,1%
Промежуточная экспансия ATXN2	4,0%
Промежуточная экспансия C9orf72	2,3%

 

Среди мутаций GBA наиболее часто встречались: L444P, N370S, E326K, T369M (первые две считаются мажорными). На репрезентативной выборке пациентов российской популяции нами показана ассоциация БП с полиморфизмом 263 SNCA-Rep1, а также с «промежуточными» экспансиями ряда генов: FMR1, ATXN2, C9orf72, которые изначально были описаны для других нейродегенеративных заболеваний. Все они могут рассматривать как факторы риска развития БП. 

Обобщая полученные данные, можно контстатировать, что с помощью различных методов ДНК-диагностики возможно выявление каузальных мутаций и ассоциированных полиморфизмов более, чем у трети пациентов с БП. Кроме того, стоит отметить, что в российской популяции не было выявлено носительства мутаций SNCA, DJ1, ATP13A2, NPC1 а также носительства патогенных полных экспансий FMR1, ATXN2, ATXN3, C9orf72 среди пациентов, страдающих паркинсонизмом.

Среди пациентов с атипичным паркинсонизмом и лобно-височной дегенерацией были выявлены носители мутаций в генах MAPT и GRN:

Мутации	Атипичный паркинсонизм, лобно-височная дегенерация
Мутации в 9-12 экзонах MAPT	1,0%
Экзонные миссенс мутации GRN	2,1%

В таблице отражены только значимые мутации: для МАРТ - в области домена, связывающегося с микротрубочками, для GRN - только экзонные замены, определенные как патогенные с помощью биоинформатических методов. 

В нашем репликативном исследовании российской популяции на ранее описанные ассоциации эссенциального тремора с полиморфизмами в LINGO1, LINGO2, SLC1A2 не подтвердились. Однако были выявлены случаи носительства редкого полиморфизма rs61737308 гена LINGO1 в 3,6% и в одном случае обнаружена патогенная мутация Arg507Cys в гене LINGO2 у пациентов с эссенциальным тремором.

При клинико-генетических сопоставлениях удалось выявить достаточно четкие фенотипические особенности для большинства исследованных генов. Данные фенотипические характеристики возможно использовать для оптимизации поиска мутаций/полиморфизмов, определяя очередность проведения молекулярно-генетических исследований.

Наш первый опыт применения разработанной нами «диагностической панели основанной на геномных технологиях нового поколения, для ранней и доклинической диагностики и профилактики социально значимых дегенеративных заболеваний мозга» уже позволил выявить ряд редких форм наследственной нейродегенеративной патологии. Мутационный скрининг 32 пациентов, отобранных согласно разработанных нами критериев, позволил выявить 13 мутаций в 11 различных генах (11 пациентов), обусловливающих 3 аутосомно-рецессивных заболевания (гены DDHD1, NPC1 и RARS) и 8 заболеваний с аутосомно-доминантным наследованием (гены SPAST, SPTBN2, GRN, GCH1, LRRK2, SQSTM1 NOTCH3 и AGER). 

ДНК-диагностика, являясь одним из важнейших инструментов молекулярной медицины и наиболее объективным методом верификации наследственных заболеваний, позволяет:
• устанавливать этиологическую и патогенетическую взаимосвязь той или иной патологии с мутациями одного гена (моногенные болезни) или нескольких генов (редкие случаи олигогенного наследования);
• выявлять ассоциацию болезни с аллельными вариантами определенных «генов предрасположенности» (мультифакторные заболевания).
В результате выполнения проекта впервые исследован наиболее полный спектр мутаций и полиморфизмов в генах (SNCA, PARK2, PINK1, DJ-1, LRRK2, GBA, АТР13А2 , MAPT, GRN, SNCA, GBA, FMR1, ATXN2, ATXN3, NPС1, C9orf72 , LINGO1, LINGO2 и SLC1A2), ассоциированных с основными нейродегенеративными заболеваниями такими как болезнь Паркинсона (БП), атипичный паркинсонизм и эссенциальный тремор у российских пациентов, с помощью известных и вновь созданных наборов реагентов, основанных на современных молекулярно-генетических методах.
Разработана и апробирована таргетная мультиплексная диагностическая панель, основанная на секвенировании нового поколения, которая направлена на секвенирование кодирующей области 300 генов наиболее значимых нейродегенеративных заболеваний, проявляющихся двигательными и когнитивными расстройствами. Применение такой диагностической панели безусловно является экономически оправданным в случае скрининга диагностически неясных случаев нейродегенеративных заболеваний, характеризующихся выраженной генетической гетерогенностью и фенотипическим полиморфизмом.
Полученные результаты применения разработанных нами диагностических продуктов позволил нам пересмотреть существующие алгоритмы ДНК-диагностики с точки зрения эффективности, информативности, трудозатрат и экономичности для каждой конкретной нозологии нейродегенерации. Полученные генетические характеристики нашей популяции по основным нейродегенеративным заболеваниям имеют не только фундаментальную, но и очевидную практическую направленность, например, при проведение ДНК-диагностики у лиц из группы риска, а также пренатальной и преимплантационной ДНК-диагностики с целью профилактики повторных случаев заболевания в семье.