Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0068

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0068
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства"
Название доклада
Разработка панели маркеров злокачественной трансформации предстательной железы для проведения ранней неинвазивной диагностики заболевания
Докладчик
Шарова Елена Ивановна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель исследования - создать аналитическую тест-систему на основе биомаркеров (геномных или метиломных или РНК или протеомных) для диагностики рака предстательной железы.

Задачи исследования:
1. Провести массированное чтение геномов, экзомов или таргетных экзомных панелей, анализ протеома, метилома и транскриптома опухолевых и неопухолевых тканей предстательной железы.
2. Выявить спектр геномных мутаций и РНК, эпигенетических изменений ДНК и белков как биомаркеров рака предстательной железы.
3. Создать аналитическую тест-систему на основе выявленного набора биомаркеров одного вида.
Актуальность и новизна исследования
Рак предстательной железы (РПЖ) является наиболее часто диагностируемым и третьим по уровню смертности злокачественным заболеванием среди мужчин в развитых странах. Однако на сегодняшний день пока не существует надежного набора ни прогностических, ни диагностических маркеров РПЖ, особенно на фоне доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ). Одним из наиболее используемых является белковый маркер ПСА крови, однако его чувствительность и специфичность недостаточны.
Перспективным подходом к поиску таких маркеров для рака простаты является изучение экспрессии генов в тканях предстательной железы методом секвенирования РНК (RNA-seq). В отличие от методов чип-гибридизации и ПЦР в реальном времени, данный подход позволяет детектировать de novo как белок-кодирующие, так и некодирующие РНК.
Из эпигенетических изменений, ассоциированных с РПЖ, особая роль отводится аберрантному метилированию ДНК. В последнее время в мире начат цикл работ, показавших как диагностическую ценность некоторых метильных маркеров для верификации результатов отрицательной биопсии, так и диагностическую ценность для скриннинговой диагностики РПЖ. Таким образом, поиск чувствительной и специфичной диагностической сигнатуры для диагностики рака простаты продолжается, и в качестве основных кандидатов рассматриваются разные виды биомаркеров.
Описание исследования

Для выполнения исследования был сформирован биобанк образцов тканей простаты, мочи и сыворотки. Сбор образцов проводился на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ РНИОИ Минздрава России) (г. Ростов-на-Дону), ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России (г. Санкт-Петербург) и Кафедры урологии МГМСУ им Евдокимова Минздрава России (г. Москва). Всего было собрано 315 образцов 50 пациентов как с верифицированными диагнозами аденома и рак простаты, так и пациентов группы контроля, из них 70 образцов сыворотки крови, 70 образцов мочи, 175 образцов ткани простаты.

Из всех образов была выделена ДНК и РНК. Далее ДНК использовалась для секвенирования как в формате полных геномов, так и в формате экзомов с использованием наборов Ampliseq (Thermo Fisher) или таргетных экзомных панелей GeneRead DNAseq Targeted Panels Prostate Cancer (Qiagen). Для выявления метиломных маркеров ДНК подвергалась бисульфитной конверсии, анализ метиломного профиля проводился на олигонуклеотидных высокоплотных метиломных чипах Infinium HumanMethylation450 BeadChip Kit (Illumina).

Для анализа протеома производилась оптимизация протокола для получения пептидного экстракта с последующим масс-спектрометрическим анализом. Масс-спектрометрический анализ был выполнен с использованием масс-спектрометра ABSciex TripleTOF 5600+с нанопоточным источником ионов ABSciex Nano Spray III и нанопоточной системой ВЭЖХ Eksigent NanoLC Ultra 2D+ с автосэмплером Eksigent NanoLC AS-2. Предварительно полученные в результате ферментативного расщепления пептидные экстракты тестировали с использованием времяпролетного мacс-спектрометра UltraFlex II TOF-TOF MALDI для проверки качества пробоподготовки.

Анализ уровня экспрессии РНК проводился путем РНК-секвенирования полных транскриптомов с предварительной обратной транскрипцией и деплецией рибосомальной рРНК. Секвенирование проводили на Ion Proton. Протокол анализа уровней экспрессии начинали с выравнивания на референсный геном. В качестве референсного генома была использована сборка hg19. В качестве аннотационного файла был использован файл gencode v19. Контроль качества проводился с использованием вычислительного пакета cutadapt, версия 1.8.1. Выравнивание на референс проводилось с использованием вычислительного пакета STAR, версия 2.4.1. Подсчет экспрессии, как и нормализация, проводились с использованием вычислительного пакета Cufflinks, версия 2.2.1.

Детекция геномных биомаркеров, осуществлялась по следующему протоколу - исходные fastq файлы обрезались по качеству с отсечкой в 16 программой cutadapt версии 1.9.1. Затем выполнялось картирование программой bwa версии 0.7.13, после чего картированные прочтения проходили шаги компенсация ошибок качеств отдельных оснований и локальное перевыравнивание вокруг инделов, выполняемые программой gatk версии 3.5-0-g36282e4. Полученный на предыдущем шаге bam файл отправлялся в анализ четырьмя программами поиска вариантов: freebayes версии 1.0.2, mutect версии 1.1.7, varscan версии 2.4.1 и vardict-java версии 1.4.5. Итоговый файл VCF с найденными вариантами получался в результате объединения выходных файлов каждой из программ поиска вариантов по следующему правилу: для детекции варианта необходимо, чтобы хотя бы два алгоритма нашли данный вариант (метод ансамбля). Варианты аннотировались программами variant-effect-predictor версии 83 и gemini версии 0.18.3, затем из вариантов убирали варианты митохондриальной части генома, а так же варианты из неосновных хромосом сборки.

Кроме того в рамках реализации непосредственно аналитической тест системы проводилась разработка наборов выделения РНК из мочи и ПЦР в реальном времени.

Результаты исследования

Из проведенных исследований 4-х групп биомаркеров, геномные биомаркеры не показали значимых различий - были выявлены 1823 нон реф варианта в 770 генах анализируемых образцов, при этом частота их присутствия в генах не отличалась в раковых и не раковых образцах.

При анализе протеомных маркеров удалось достоверно оценить представленность белков 2679 генов. Из них у 93 наблюдается достоверное различие (p-значение <= 0.05) представленности соответствующего белка в раковой и не раковой тканях. Исследования не показали различий между 2-мя из 3-х стадий гиперплазии, а именно между стадией аденомы и нормальной тканью, что позволило объединить пациентов с аденомой и пациентов без рака и гиперплазии в единую контрольную группу. Иерархическая кластеризация так же не показала группировки образцов с суммой Глиссона 6 и 8 в разные участки на дендрограмме, т.е. на уровне протеома удается увидеть различия только между состоянием с опухолевым ростом и без опухолевого роста.

Наиболее информативными оказались метиломные и транскриптомные маркеры. Для формирования кандидатного диагностического набора маркеров на основе метилома мы провели отбор участков, наиболее достоверно отличающихся в группах рак и не рак - было обнаружено 21610 гиперметилированных CpG сайтов. Далее данный набор был скорректирован так, что осталось 183 дифференциально метилированных CpG сайта. Далее на основе экспериментальных значений метилирования по этим сайтам была рассчитана диагностическая модель, основанная на логистической регрессии. После этого модель была успешно валидирована с использованием независимого массива данных проекта Атлас Ракового Генома (TCGA). Итоговый список составил шесть CpG сайтов. Находятся они в генах LRRC17, LRRC18, KCNJ3, ZIC5, PON3 и локализованы, как правило, в составе охарактеризованных CpG островков. Однако верификация данных сайтов методом секвенирования по Сэнгеру не показала воcпроизводимости чиповых результатов по всем генам, за исключением 2-х сайтов метилирования в генах KCNJ3 и ZIC5. Однако 2 сайта не составляют цельную диагностическую сигнатуру в лабораторно приемлемом формате, поэтому метиломная панель не была отобрана в итоговую аналитическую тест систему.

Анализ типов генов с ненулевой экспрессией хотя бы в 40 из 50 образцах опухолевой и не опухолевой ткани показал, что преимущественно детектируется экспрессия белок-кодирующих генов, при этом обнаружено достаточное количество длинных некодирующих РНК, к которым мы относим в том числе и экспрессирующиеся псевдогены. Анализ дифференциально экспрессированных генов показал, что всего 6296 генов являются достоверно дифференциально экспрессированными (с поправкой на множественное сравнение не более 0.01). Из них у 2667 генов экспрессия в опухолевой ткани выше, чем в нормальной, а у 3629 генов выше экспрессия в не опухолевой ткани. Так как максимальное отличие экспрессии в опухолевой ткани по сравнению с не опухолевой не более чем 4.001 log2FC, то для определения спектра РНК, специфических для опухолевых клеток был взят порог 2.5. В результате нами было обнаружено РНК 35 таких генов, из которых 8 подтвердили свою потенциальную диагностическую маркерность по данным литературы. Все 8 маркерных генов были проверены при разработке аналитической тест системы, и из 3-х, показавших наилучшую диагностическую чувствительность и специфичность, и был составлена итоговый набор МРП4.

Практическая значимость исследования
В данном исследовании предпринята первая в России попытка мультиомиксного исследования рака предстательной железы. Она позволила охарактеризовать потенциальную диагностическую ценность разного вида биомаркеров, выявив среди них наиболее перспективные для данной патологии метиломные и транскрипционные маркеры. Разработанная аналитическая тест-система, имеющая лучшую чувствительность и специфичность по сравнению с существующими диагностическими маркерами ПСА крови и и ПСА3 мочи. в перспективе позволит уменьшить число пациентов, направляемых на первичную биопсию простаты.
Постер

Poster_NZH_0068.ppt