Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0151

Аннотация скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0151
Тематическое направление
Индустрия наносистем
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации
Название доклада
Разработка мембранного каскадного электродиализатора для сепарации стволовых клеток и факторов роста с использованием функциональных микро-и нанобиопористых мембран
Докладчик
Решетов Игорь Владимирович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цели проекта:
1.1 Разработка технологии получения полностью сохранных биологически активных веществ, факторов роста и стволовых клеток из биологических сред.
1.2 Разработка мембранного каскадного электродиализатора обеспечивающего реализацию технологии получения полностью сохранных биологически активных веществ, факторов роста и стволовых клеток из биологических сред.
1.3 Разработка основных принципов получения каскадных микро-и нанобиопористых мембран с модифицированной пространственной конфигурацией для каскадного электродиализа на их основе, в том числе и с использованием мембран, модифицированных аффинными антителами к специфическим маркерам для выделения полностью сохранных биологически активных веществ, факторов роста и стволовых клеток из биологических сред, таких как кровь и жировые ткани.

Задачи проекта:
1. Разработка метода простого, быстрого и «деликатного» разделения ультратонких структур и биологически активных компонентов крови и жировых тканей, в частности, таких как стволовые клетки и факторы роста.
2. Отработка методики формирования сложного пространственного 3D матрикса микро- наноперфорированных биосовместимых мембран.
3. Разработка и методики верификации поверхностных биоактивных структур крови и жировой ткани.
4. Оценка сохранности молекул после фильтрации в аспекте дальнейшего применения в медицине и биологии, в частности крайне важно сохранить белковые рецепторы плюрипотентных стволовых клеток для возможности топического воздействия.
Актуальность и новизна исследования
АКТУАЛЬНОСТЬ
Развитие современной медицины и биологии напрямую связано с внедрением высокотехнологичных методов получения биологически активных веществ и тканевого инжиниринга. Ткани живых организмов обладают огромным потенциалом, использовать который можно лишь с применением последних достижений в области нанотехнологий и регенеративной медицины. Выделение ультралегких биологически активных веществ и стволовых клеток без их повреждения в процессе фильтрации, на сегодняшний день представляет нерешенную проблему в мировой медицине и биологии. На сегодняшний день невозможно говорить о создании артифициальных органов и их частей без простых и доступных способов получения основного субстрата – собственных стволовых клеток, и факторов воздействия на них же. Человечески организм содержит в себе все необходимое для собственного воспроизводства, просто нужно научиться, это получать. Селективное получение факторов роста, таких например, как тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный факторов роста, инсулиноподобный фактор роста позволит программировано влиять на дифференцировку стволовых клеток, регенерацию тканей и клеточную пролифирацию. Необходимость отечественных
разработок в данном направлении очевидна.
НОВИЗНА
Впервые будет осуществлено комплексное исследование принципов каскадного электородиализа в сочетании с использованием функциональных мембран с модифицированной пространственной конфигурацией для прецизионной выделения живых структур крови. Будут разработаны новые эффективные методики получения неповрежденных биологически активных факторов и стволовых клеток с сохранными рецепторами не имеющие мировых аналогов.
Описание исследования

Для достижения целей исследования небходимо было получить микро- и нанопористые трековые мембраны (МНМ) с модифицированной пространственной конфигурацией, обладающие широким спектром сепарационных свойств, которые являются ключевым элементом каскадного электродиализатора для фракционирования стволовых клеток и факторов роста в биологических средах.  Трековые мембраны (ТМ) – это тонкие пористые пленки, система пор в которых получается по методу, включающему несколько стадий: облучение исходной пленки высокоэнергетичными заряженными частицами; сенсибилизация треков УФ-излучением с дополнительным разрывом межмолекулярных связей в зоне трека и окислению продуктов радиолиза; химическое травление треков до образования сквозных пор нужного размера; нейтрализация остатков реагентов, промывка и сушка. Строгая селекция массы и энергии частиц, бомбардирующих пленку,  позволяет получить систему однородных по форме и размерам пор. Следствием этого является рекордно узкое распределение пор по размерам и высокая селективность ТМ. Эти структурные особенности трековых мембран обеспечивают корректную интерпретацию результатов экспериментальных  исследований механизма мембранной фильтрации  и высокую селективность трековых мембран в процессах микро- и ультрафильтрации. Другим преимуществом трековых мембран является ситовый механизм фильтрации, позволяющий проводить многократную регенерацию фильтра, что намного увеличивает срок его работы. Важнейшими эксплуатационными параметрами мембраны являются селективность и производительность. Производительность ТМ пропорциональна  их пористости. Пористость ТМ при данном диаметре пор, определяющем ее селективность, зависит от  поверхностной плотности пор, т.е., в конечном счете, от флюенса облучения. Повышать его можно только до определенных пределов, так как при высоком флюенсе резко возрастает вероятность перекрытия пор, снижающего селективность мембраны.   В рамках ПНИ был разработан ионно-трековый метод получения микро-и нанопористой трековой мембраны для разделения клеток  и их культивации на основе метода двойного облучения и травления. Были взяты исходные пленки из ПЭТФ толщиной 30 мкм, которые были облучены тяжелыми ионами с флюенсом порядка 106 см-2. После травления были получены структуры в виде несквозных пор диаметром 4-5 мкм и длиной каналов порядка 20 мкм.  После было проведено вторичное облучение непротравленной области с флюенсом 106 см-2 с целью получения нанометровых каналов, которые не пропускают крупные клетки, но могут беспрепятственно обеспечивать доступ БАВ для их культивации. Диаметр таких каналов должен составлять 2 или менее мкм. Для идентификации и изоляции стволовых клеток используются клеточно-поверхностные антитела (маркеры), большинство из которых основаны на знании тканевого развития или происходят из гематопоэтических или эмбриональных стволовых клеток. В качестве модельных маркеров для модификации поверхности МНМ были выбраны наиболее часто используемые поверхностные маркеры для идентифицирования СК - CD133 и CD44. Антитела к СК представляют собой гликопротеиды - двухкомпонентные белки, в которых пептидная часть молекулы ковалентно соединена с одной или несколькими группами гетероолигосахаридов. Нами также был предложен метод модификации МНМ путем создания сложных полиэлектролитных комплексов. Перед нанесением модифицирующего реагента на мембрану наносится слой полимера-посредника (праймера), функциональные группы которого способны к взаимодействию как с ионогенными группами поверхности мембраны, так и с функциональными группами антитела, представляющего собой гликопротеид, имеющий на своей поверхности функциональные амино и карбоксильные группы. В качестве такого полимера может быть использован разветвленный полиэтиленимин. Праймер характеризуется наличием первичных, вторичных и третичных аминогрупп. В результате такой модификации образуется полиэлектролитные комплексы, прочно связанные с поверхностью. Между карбоксильными и гидроксильными группами трековой мембраны и амидными группами полиэтиленимина образуется прочная связь по донорно-акцепторному механизму. Для модификации исходных МНМ с диаметром пор 0,4 мкм в качестве модельной нами были использованы растворы разветвленного ПЭИ в воде различной концентрации (0.01%масс – 1%масс). После разработки и получения МНМ были изготовлены экспериментальные образцы КЭД. Произведено его тестирование на модельных системах с использованием экспериментальных образцов набора каскадных МНМ с модифицированной пространственной конфигурацией.

Результаты исследования

Выполнен аналитический обзор информационных источников, патентные исследования, проведена сравнительная оценка эффективности возможных направлений исследований в рамках разделения СК и ФР. Осуществлены выбор и обоснование направлении исследовании, создана экспериментальная база. Разработаны: методики облучения высокоэнергетическими частицами, обработки УФ-излучением для создания асимметрии; методика химического травления для получения пор с переменным по длине сечением. Проведена доработка и модификация оборудования. Разработаны условия получения экспериментальных образцов МНМ с модифицированной пространственной конфигурацией. Разработан новый тип трековых мембран. Проведены исследования, устанавливающие взаимосвязь между структурой и свойствами каскадных нанопористых мембран с модифицированной пространственной конфигурацией с качеством получаемых БАВ, ФР и СК. Подготовлен набор микро-и наноструктурированных трековых мембран для использования в каскадном электродиализаторе; дана характеристика структурно-селективных свойств трековых мембран, что позволило создать перечень мембран, рекомендуемых для использования. Для сепарации стволовых клеток выбраны следующие мембраны: микроструктурированные изотропногоТМ с диаметром пор 7- 8мкм для отделения/обогащения СК от эритроцитарной массы; наноструктурированные асимметричные ТМ с диаметром пор 20 нм для концентрирования и диализа ФР; наноструктурированные изотропные ТМ с диаметром 50-70 нм для отделения БАВ (гемоглобин, альбумин, иммуноглобулины) от ФР. Это означает что свойства и структура выбранных микро- и нанопористых мембран позволяет получить БАВ, ФР и СК максимального качества. Разработана техническая документация на экспериментальные образцы КЭД и набор каскадных микро- и нанобиопористых мембран. Разработана концепция изготовления устройства КЭД. На ее основании разработана конструкторская документация для изготовления КЭД. Конструкторская документация в виде чертежей на изготовление элементов КЭД с объемными камерами 50 и 1000 мкл. На основании документации изготовлены элементы КЭД. Разработан лабораторный регламент изготовления набора каскадных МНМ. Выполнено изготовление экспериментальных образцов набора каскадных МНМ с модифицированной пространственной конфигурацией. Выполнена разработка программ и методик испытаний экспериментальных образцов набора каскадных МНМ. Осуществлено проведение испытаний экспериментальных образцов набора каскадных микро- и нанобиопористых мембран по разработанной программе и методикам испытаний. В рамках обеспечения участия в мероприятиях, направленных на освещение и популяризацию промежуточных и окончательных результатов: представлен и защищен постерный доклад на научно-практической конференции по итогам реализации в 2015 году прикладных научных исследований и экспериментальных разработок в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы», которая была организована в рамках национальной выставки ВУЗПРОМЭКСПО-2015 2 по 4 декабря 2015 года Министерством образования и науки Российской Федерации. В 2016 году был представлен доклад на IV Междисциплинарном конгрессе по заболеваниям органов головы и шеи, в рамках Второй Международной конференции «Инновационные методы и технологии для биомедицинских приложений».

Практическая значимость исследования
Применение результатов проекта перспективно в здравоохранения. В частности в регенеративной медицине и тканевой инженерии. Любой процесс в живых организмах нуждается в регуляторных факторах и если до последнего времени мы могли влиять на любые биологические процессы весьма косвенно, то в ближайшем будущем с применением нанотехнологий мы сможем перейти на качественно новый уровень.
Селективное получение факторов роста таких например как тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный факторов роста, инсулино-подобный фактор роста позволит программировано влиять на дифференцировку стволовых клеток , регенерацию тканей и клеточную пролиферацию.
Внедрение в российскую медицинскую науку методики получения стволовых клеток и факторов роста с помощью разработанных в результате ПНИ каскадных микро- и нанобиопористых мембран с модифицированной пространственной конфигурацией, на основе которых будет создан образец мембранного каскадного электродиализатора, позволит вывести на новый уровень такие направления, как тканевая инженерия и биология, а также базирующиеся на этом новые революционные методики получения органов и тканей в различных направлениях клинической медицины. Это позволит внедрить в клиническую практику новые методики и существенно улучшить результаты лечения различных заболеваний.
Создание прототипа прибора для широкого применения в медицине и биологии. Например для интраоперационного получения факторов роста и сохранных стволовых клеток средней степени дифференцировки. Оптимизация данного процесса позволит поднять на качественно новый уровень оказания медицинской помощи и лечения по различным направлениям современной медицины.