Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0113

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0113
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"
Название доклада
Разработка генетических конструкций для коррекции митохондриальных дисфункций
Докладчик
Каменский Петр Андреевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
1 Разработка теоретических основ импорта макромолекул в митохондрии
2 Разработка структуры генетической конструкции (макромолекулы) для коррекции митохондриальной дисфункции
3 Разработка метода доставки генетической конструкции (макромолекулы) в митохондрии.
4 Разработка протокола для оценки эффективности действия генетической конструкции
Актуальность и новизна исследования
Методы лечения наследственных заболеваний человека при помощи генно-терапевтических подходов в последние годы развиваются взрывообразно. Однако необходимо отметить, что все успехи генной терапии последних лет связаны исключительно с подавлением мутаций в ядерном геноме человека. В то же время, в клетках человека имеется еще и митохондриальный геном, и мутации в нем в общечеловеческой популяции фиксируются с достаточно высокой частотой. Зачастую такие мутации являются причиной тяжелых наследственных заболеваний, преимущественно нейромышечного характера Ни один из общепризнанных генно-терапевтических подходов не пригоден для подавления мутаций в митохондриальном геноме. Это связано с тем, что в подавляющем большинстве случаев генно-терапевтическим агентом является нуклеиновая кислота (ДНК или РНК), и их направленная доставка в митохондрии является технически сложной задачей. Таким образом, проблемы направленного транспорта нуклеиновых кислот в митохондрии клеток человека, представляются весьма актуальными.
Существует множество различных подходов к доставке нуклеиновых кислот в митохондрии с последующей супрессией патогенных мутаций в геноме органелл. Тем не менее, до внедрения таких подходов в медицинскую практику еще очень далеко. В первую очередь, нужно отметить, что ни один из разработанных к настоящему моменту подходов не характеризуется достаточно высокой эффективностью. Помимо этого, для супрессии каждой конкретной мутации обычно разрабатывается отдельный подход. Наконец, поскольку адекватных животных моделей митохондриальных болезней не существует, ни один из подходов не был апробирован на уровне целого организма (все эксперименты проводились только на культурах клеток).
Описание исследования

По последним данным, мутации в митохондриальном геноме встречаются примерно у каждого 250-го жителя Земли. Зачастую такие мутации приводят к развитию тяжелых наследственных заболеваний, в основном, нейромышечного характера. Пациенты с такими заболеваниями характеризуются крайне низким качеством жизни и малой ее продолжительностью. В медицинской практике для лечения
митохондриальных болезней в настоящее время используют исключительно симптоматические подходы, которые часто оказываются неэффективными и совершенно не решают проблемы передачи болезни потомкам пациентов. В научной литературе описано несколько генно-терапевтических стратегий супрессии мутаций в митохондриальном геноме, однако все они еще очень далеки от внедрения в
медицинскую практику.
Таким образом, глобальной задачей настоящего проекта является создание новых и/или совершенствование существующих генно-терапевтических подходов к лечению митохондриальных болезней человека с целью их дальнейшего использования в медицине.
В качестве возможных путей решения задачи проекта мы использовали два пути. Оба они основаны на процессах импорта нуклеиновых кислот в митохондрии. Именно этот процесс является основой самых эффективных из описанных к настоящему моменту генно-терапевтических стратегий супрессии мутаций в митохондриальном геноме. Вкратце, суть данных стратегий заключается в доставке в митохондрии молекул нуклеиновых кислот, которые либо функционируют в органеллах вместо мутантных молекул, либо тем или иным образом подавляют экспрессию митохондриальной ДНК, несущей мутацию. В обоих случаях митохондриальная функция может частично восстанавливаться до значений, близких к нормальным.
Первый путь решения задачи проекта - это совершенствование уже разработанных стратегий супрессии мутаций в митохондриальном геноме. Для этого потребуется, во-первых, увеличение объема наших знаний относительно молекулярных механизмов процесса импорта нуклеиновых кислот в митохондрии, а во-вторых, работы, направленные на создание новых генетических конструкций, обладающих повышенной эффективностью импорта в митохондрии и супрессии патогенных мутаций в геноме органелл.
Второй путь решения задачи проекта - это разработка новых способов доставки нуклеиновых кислот в митохондрии. Доставка в условиях in vivo может происходить либо по естественным механизмам импорта нуклеиновых кислот, либо посредством белков-переносчиков. Существует предположение, что молекулы ДНК, по тем или иным причинам оказавшиеся вблизи митохондрий, могут спонтанно проникать в органеллы, однако эффективность этого процесса крайне низка. Мы предположили, что эффективность такого транспорта можно повысить, если в процессе будет участвовать некий белок, с высокой аффинностью связывающийся с ДНК и импортирующийся в митохондрии.
 

Результаты исследования

В ходе исследования был выбран белок-кандидат на роль переносчика терапевтической генетической конструкции в митохондрии. Им стал основной белок дрожжевого митохондриального нуклеоида Abf2p. Выбор был обоснован тем, что, по имеющимся данным, этот белок достаточно сильно и не специфично связывается с молекулами ДНК. Были описаны основные физико-химические свойства Abf2p. Было показано, что два его домена обладают различным сродством к различным структурам ДНК, однако неспецифическое связывание с ДНК сильнее всего выражено именно для полноразмерного белка. Также было продемонстрировано, что Abf2p связывается с двуцепочечной ДНК в форме мономера, и что длина участка его связывания составляет 13 пар нуклеотидов. Наконец, в предварительных экспериментах было показано, что связывание Abf2p с ДНК действительно увеличивает эффективность импорта нуклеиновой кислоты в митохондриях.

В качестве модельной мутации митохондриальной ДНК использовалась так называемая "основная делеция", при которой из последовательности митохондриальной ДНК человека исчезает участок длиной около 5000 пар нуклеотидов. Была разработана генетическая конструкция, представляющая собой двуцепочечную ДНК, полностью соответствующую участку митохондриального генома, вырезаемого вследствие "основной делеции". Генетическая конструкция была смоделирована таким образом, что при попадании в митохондрии, содержащие ДНК с "основной делецией", она должна была встраиваться в мутантные молекулы генома за счет процессов гомологической рекомбинации. Была проведена одновременная трансфекция клеток человека, несущих "основную делецию" в митохондриальной ДНК, разработанной генетической конструкцией и белком Abf2p в оптимальном молярном соотношении. Было показано, что через несколько дней после трансфекции количество мутантных молекул митохондриальной ДНК в клетках сокращалось примерно вдвое, а интенсивность митохондриального дыхания увеличивалась в несколько раз. Таким образом, была продемонстрирована коррекция митохондриальной дисфункции вследствие использования разработанной в ходе проекта генетической конструкцией вместе с ее вспомогательным компонентом, белком Abf2p, увеличивающим эффективность транспорта генетической конструкции в органеллы.

Практическая значимость исследования
Результаты проекта позволили приблизиться к внедрению в медицинскую практику генно-терапевтических подходов к супрессии мутаций в митохондриальном геноме. Результаты проекта могут быть использованы в дальнейшем для разработки соответствующих технологий, проведения доклинических и клинических испытаний таких подходов. В перспективе, результаты проекта позволят значительно
улучшить качество жизни пациентов, страдающих наследственными митохондриальными заболеваниями.