14.616.21.0009

совместное использование существующих и перспективных рентгеновских источников в Гамбурге для применения в биомедицинских и клинических исследованиях при эквивалентном участии ведущих исследовательских групп из России и Германии. Первоочередной задачей проекта является создание, совершенствование и объединение аппаратного и программного обеспечения, непосредственно связанных с синхротронной и FEL инфраструктурами, которые, в свою очередь, будут активно использоваться в проекте. Второй и третьей задачами будет вплетение биомедицинских проектов высокой значимости в разработанные технологические платформы

Изучение особенностей трехмерной, пространственной организации белков позволит выявить взаимосвязи с их функционированием в рамках осуществления конкретных процессов. В качестве объектов для структурных исследований большой интерес всегда представляли природные биокатализаторы – ферменты, т. к. без пространственной структуры последних невозможно понимание молекулярных механизмов их действия и работа по целенаправленному управлению их свойств. Каталитические антитела (абзимы) являются особой группой биокатализаторов, поскольку объединяют в себе традиционное свойство ферментов – способность эффективно осуществлять катализ, с низкой иммуногенностью, высокой специфичностью связывания мишени и возможностью длительного существования в кровотоке, характерными для молекул иммуноглобулинов. В последнее время в кристаллографии появилась новая парадигма свидетельствующая о возможности получения дифракции на микрокристалах, которые ранее рассматривались слишком малоразмерными для синхротронных источников. Эта возможность появилась благодаря работе над FEL источниками. Так называемая фемтосекундная кристаллография или «SFX» (Chapman , 2011 ; Буте, 2013 ). Фемтосекундные импульсы не причиняют значительных радиационных повреждений, тем самым снимая ограничения по критической дозе облучения. Это позволяет получать структурную информацию с кристаллов размером менее 200 нм при комнатной температуре. Данный подход может быть осуществлен с использованием синхротронного излучения при анализе суспензии микрокристаллов в потоке при комнатной температуре и с криогенно охлажденными микрокристаллами. Указанные подходы могут получить широкое применение в структурной биологии.

Методы проведения работы - генная и клеточная инженерия, биотехнология, белковая химия, твердофазного пептидного синтеза, хроматография, ЯМР и масс-спектрометрии, иммуноферментный анализ, кристаллографии и синхротронного излучения.

В этом проекте мы развиваем  методологию поточного кристаллографического анализа, а именно – разработка надежной и воспроизводимой технологии на основе существующей передовой практики кристаллографии макромолекул. В настоящее время наибольший объем данных о расшифрованных пространственных структурах как белков, так и их комплексов с лигандами различной природы централизованно хранится в банке данных — Protein Data Bank (www.rcsb.org), созданном в 1971 г. В Брукхейвенской национальной лаборатории (США). На ноябрь 2014 г. насчитывается более 97000 структур белков, при том, что подавляющее большинство данных (89,5%) было получено с использованием метода РСА. Рекомбинантные каталитические антитела рассматриваются как привлекательные матрицы для получения искусственных биокатализаторов de novo и их использования в качестве терапевтических агентов.

На 1 этапе работ по Соглашению были проведены подготовительные мероприятия для проведения  структурных исследований рекомбинантных белков:

         проведены патентные исследования;

         проведен обзор современной научно-технической литературы по проблеме, исследуемой в рамках ПНИ;

         разработан  план исследований проведения ПНИ;

         созданы суб-библиотеки активных центров каталитических антител A17 и/или A5;

         проведены эксперименты по молекулярному моделированию, молекулярной динамике и квантово-механическим расчетам (MD, QM) с использованием техники "докинга" функционально-активных антител и предложен алгоритм предсказания наиболее активных мутантов с улучшенными потребительскими свойствами;

         получены генетические конструкции и разработана лабораторная методика экспрессии селектинов и Fra-2 на основе бактериальных или эукариотических клеток с целью получения высокоочищенных белков;

         иностранным партнером проведены подготовительные исследования по уменьшению фона при анализе методом поточной кристаллографии и по сокращению времени накопления данных и оптимизация анализа на синхротроне.

На 2 этапе исследований по Соглашению были наработаны рекомбинантные белки и разработан метод «On-The-Fly», а именно:

         получены оригинальные вектора и разработана лабораторная методика экспрессии рекомбинантных каталитических антител;

         проведен скрининг суб-библиотеки активных центров каталитических антител A17 и/или A5;

         наработаны экспериментальные партии рекомбинантных селектинов и Fra-2, пригодные для кристаллизации.

В результате исследований 3 этапа по наработке и структурным исследованиям рекомбинантных белков были выполнены работы:

    проведены дополнительные патентные исследования;

         осуществлена наработка экспериментальных партий вариантов рекомбинантного каталитического антитела А5, пригодных для кристаллизации;

         проведен структурно-функциональный анализ каталитического антитела А5 и его иммунокомплексов с лигандами;

         иностранным партнером проведены исследования по разработке протокола обработки данных методом «CFEL Petabyte Diffraction Farm»;

         иностранным партнером проведены исследования по сокращению времени накопления данных и оптимизации анализа на синхротроне до 3 часов;

         совместно с иностранным партнером проведены кристаллизация и первые структурные исследования рекомбинантных препаратов полноразмерного фактора транскрипции Fra-2;

         совместно с иностранным партнером проведена кристаллизация каталитического антитела FabA5 и его иммунокомплекса с фосфонатом.

При  выполнении 4 этапа данного Соглашения были осуществлены работы:

1)        наработаны экспериментальные партии, отобранных из суб-библиотеки вариантов рекомбинантных каталитических антител, пригодных для кристаллизации;

2)        проведен структурно-функциональный анализ каталитических антител, отобранных из суб-библиотеки, и их иммунокомплексов с лигандами;

3)        проведены физико-химические исследования новых биокатализаторов.

По результатам выполнения 4-го этапа  Соглашения получены следующие основные результаты:

         была проведена наработка 21 мутантной формы антител L-S35R-kappa, L-S35K-kappa, L-S35H-kappa, L-S35E-kappa, L-S35A-kappa, L-P98R-kappa, FabA17_DRD-kappa, FabA17_RDE-kappa, FabA17_DER-kappa, FabA17_RED-kappa, L-S35R-lambda, L-S35K-lambda, L-S35H-lambda, L-S35E-lambda, L-S35A-lambda, L-P98R-lambda, FabA17_DRD-lambda, FabA17_RDE-lambda, FabA17_DER-lambda, FabA17_RED-lambda и H-L99R для проведения структурно-функционального анализа;

         была проведена наработка антитела FabA17_Ser35Arg в количестве 20.2 мг для стандартной кристаллизации;

         была проведена препаративная наработка антител и FabA5_kappa в количестве 22.1 мг и FabA5_lambda в количестве 25.3 мг для проведения микрокристаллизации. Акты наработки представлены в комплекте отчетной документации;

         было установлено, что антитела L-S35E, L-S35A, L-P98R, не обладают активностью ни к одному из фосфорорганических субстратов. Антитела FabA17_DRD, FabA17_RDE, FabA17_DER и FabA17_RED обладают крайне низкой реакционной способностью по отношению к параоксону параоксоном. Антитела L-S35R, L-S35K и L-S35H-обладают способностью связываться со всеми субстратами параоксонового ряда с эффективностью более чем в сто раз превышающую аналогичную активность исходного антитела A17. Эти данные согласуются с результатами компьютерных расчетов полученными на этапе 1.5. Константный домен легкой цепи не оказывает значительного влияния на связывание, однако в среднем активность каппа-вариантов выше;

         была проведена кристаллизация и структурный анализ антитела FabA17_Ser35Arg нативного и в комплексе с параоксоном;

         были получены структуры Fab-фрагмента мутанта FabA17_Ser35Arg антитела А17 и его аддукта с остатком параоксона были установлены с разрешением 2.1 Å и 1.6 Å соответственно.

Область применения – медицина, фармакология, биотехнология, нейробиология, биохимические исследования, кристаллография белков.
Возможные потребители ожидаемых результатов, а также возможные пути и необходимые действия по доведению до потребителя ожидаемых результатов, в том числе на международной арене - Минпромторг РФ; Минобороны РФ; МВД РФ; МЧС РФ; Минздрав РФ; университеты и вузы РФ и ФРГ; научно-исследовательские профильные Институты, включая международные; отечественные и зарубежные фармацевтические компании. Отобранные кандидатные антитела с оптимальными потребительскими свойствами могут быть поданы на конкурс работ Минпромторга РФ «Фарма 2020» для проведения доклинических и клинических испытаний. Структуры селектинов человека и мыши в комплексе с углеводными остатками сиалил-Льюис X и А, а также иммунокомплексы могут рассматриваться в ходе НИР и контрактами с фармкомпаниями для разработки терапевтических средств при лечении аутоиммунных заболеваний и борьбы с метастазированием при онкологических заболеваниях.