Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0115

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0115
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук
Название доклада
Разработка экспериментальной модели in vitro и in vivo для изучения патогенеза спорадической формы болезни Паркинсона, поиска биомаркеров заболевания и скрининга обладающих нейропротективными свойствами биологически активных соединений на основе природных регуляторных нейропептидов
Докладчик
Сломинский Петр Андреевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Разработка экспериментальных моделей для выявления потенциальных биомаркеров и лекарственных мишеней для спорадической формы болезни Паркинсона, связанной с патологическими конформационными превращениями белков. Исходя из этого, в рамках проекта предполагается:
- разработать методику оценки нейропротективных свойств соединений с использованием разработанной экспериментальной модели, основанной на использовании индуцированных плюрипотентных стволовых клеток от пациентов со спорадической формой болезни Паркинсона и создать экспериментальный образец тест-системы для отбора in vitro соединений, обладающих такими свойствами;
- разработать методику оценки нейропротективных свойств соединений in vivo на основе токсической модели болезни Паркинсона с введением крысам 6-гидроксидофамина;

- с использованием предложенных моделей провести оценку нейропротекторных свойств новых разработанных на основе природных регуляторных пептидов, образующихся при протеолитическом процессинге препропептида нейротрофического фактора глиальных клеток, пептидных препаратов с предполагаемой нейропротекторной активностью.
- выявить биомаркеры, связанные с развитием патологического процесса при болезни Паркинсона, и оценить возможность их использования для ранней и доклинической диагностики данного заболевания.
Актуальность и новизна исследования
Болезнь Паркинсона (идиопатический или первичный паркинсонизм, БП) - группа хронических прогрессирующих нейродегенеративных заболеваний, связанных с нарушением деятельности базальных ганглиев головного мозга. Необходимо отметить, что понимание этиопатогенеза болезни Паркинсона далеко от разрешения и для дальнейшего его изучения необходимо развитие и совершенствование экспериментальных моделей паркинсонизма. Наиболее адекватной представляется комплексная модель, сочетающая модель in vitro (на культуре нейрональных клеток) и модель in vivo (нейротоксическая модель заболевания).
Такая двойная (in vitro и in vivo) модель даст возможность анализировать связанные с развитием патологического процесса изменения транскрипционного паттерна и протеома нейрональных клеток как в относительно простой системе на полученных из ИПС клеток нейрональных клетках, так и на системе целостного мозга с системной гибелью разных типов нейронов. Это даст возможность проследить за разными стадиями развития патологического процесса и выявить новые потенциальные биомаркеры, связанные с процессом гибели дофаминэргических нейронов. Эти биомаркеры могут быть использованы при разработке панели маркеров для ранней клинической и доклинической болезни Паркинсона.Эта модель также позволит проводить быстрый скрининг потенциальных нейропротекторов - причем на первой стадии скрининга будет использоваться система in vitro для выявления веществ с нейропротекторной активностью и первичной оценки их биологической активности. На второй стадии успешно показавшие себя потенциальные нейропротекторы можно будет анализировать уже на модели in vivo, и оценивать ответ на эти нейропротекторы на уровне целостного организма.
Описание исследования

В    основу   проекта   положено   создание    комплексной  модели   для   изучения  этиопатогенеза  болезни Паркинсона (БП),  сочетающей модель in vitro (на культуре нейрональных клеток) и модель in vivo (нейротоксическая модель заболевания). В качестве модели in vitro в данном проекте были  использованы индуцированные плюрипотентные клетки (iPS cells, ИПС). Исследование культур нейронов, получаемых на основе технологии ИПС клеток из фибробластов больных спорадическими формами БП, позволит оценить взаимосвязь между дегенеративными изменениями в нейронах и характером клинического синдрома. Как модель in vivo будет использована нейротоксическая модель БП на грызунах,  основанная на введении  крысам 6-гидроксидофамина (6-ГДА), Длительный характер развития процессов нейродегенерации в 6-ГДА модели в большой степени воспроизводит процесс дегенерации дофаминэргических нейронов при болезни Паркинсона у человека и это позволяет вести эффективный скрининг нейропротекторов с длительным введением препарата. Двойная (in vitro и in vivo) модель даст возможность анализировать связанные с развитием патологического процесса изменения транскрипционного паттерна и протеома нейрональных клеток как в относительно простой системе на полученных из ИПС клеток нейрональных клетках, так и на системе целостного мозга с системной гибелью разных типов нейронов. Это с одной стороны даст возможность проследить за разными стадиями развития патологического процесса и выявить новые потенциальные биомаркеры, связанные с процессом гибели дофаминэргических нейронов. Эти биомаркеры могут быть использованы при разработке панели маркеров для ранней клинической и доклинической болезни Паркинсона. С другой стороны, эта модель позволит проводить быстрый скрининг потенциальных нейропротекторов - причем на первой стадии скрининга будет использоваться система in vitro для выявления веществ с нейропротекторной активностью и первичной оценки их биологической активности. На второй стадии успешно показавшие себя потенциальные нейропротекторы можно будет анализировать уже на модели in vivo, и оценивать ответ на эти нейропротекторы на уровне целостного организма.

Такого рода нейропротекторы могут быть разработаны на базе природных регуляторных пептидов. Ранее было показано, что нейротрофический фактор глиальных клеток GDNF играет важную роль в нормальном функционировании дофаминэргических нейронов нигростриатной системы - синтезируемый в стриатуме GDNF необходим у крыс для нормального формирования связи между нейронами черной субстанции и стриатума. Анализ структуры препро-GDNF позволил предположить, что в результате протеолитического процессинга могут образовываться короткие пептиды и эти пептиды могут также обладать биологической активностью. Наиболее интересен пептид DNSP-5 размером 5 аминокислот, который высоко консервативен у человека, приматов и грызунов. Малый размер пептида также облегчает создание вариантов этого пептида - например, замена остатка лейцина на остаток глицина приведет к созданию пептида, гомологичного пептиду семакс MEHFPGP. Использованные при создании пептидов семакса и селанка методы стабилизации их структуры c использованием пептида PGP могут быть использованы и для модификации пептида DNSP-5 с целью повышения его устойчивости к действию протеаз. В итоге в рамках проекта будет создано целое семейство пептидов на базе различных фрагментов препропептида GDNF и их нейропротекторная активность будет оценена на создаваемой двухэтапной in vitro и in vivo системе моделирования болезни Паркинсона.

Таким образом, при выполнении проекта предполагается решение трех взаимосвязанных высоко актуальных для современной нейробиологии и нейропатологии задач: создание сочетанной (in vitro и in vivo) модели болезни Паркинсона, поиск и анализ биомаркеров ранней стадии развития патологического процесса, поиск и характеристика новых пептидных нейропротекторов для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Результаты исследования

 Для   проведения  работ  по  изучению  этиопатогенеза  болезни Паркинсона (БП) in  vivo     получена    модель   заболевания на основе токсического повреждения области черной субстанции мозга крыс  в  результате  введения   токсина  6-гидроксидофамина. Анализ транскриптомного паттерна черной субстанции мозга крыс с экспериментальной моделью патогенеза позволил выявить  пять генов (PVALB, GRM1, WFS1, РРТ1и NMU), которые можно отнести к группе генов-кандидатов БП. Полученные  результаты   были   положены  в  основу   работ  по анализу биомаркеров (транскрипционных маркеров) в периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона. В результате удалось сформировать панель транскрипционных РНК маркеров (включающую гены ATP13A2, PARK7, ZNF746, SNCA) для оценки возможности их использования в ранней и доклинической диагностики заболевания. Разработана методика для анализа относительных уровней транскриптов трех генов ZNF746, PARK7, ATP13A2, для рутинного использования в лабораторной и клинической практике.  Для   создания    модели  этиопатогенеза   БП in  vitro были получены индуцированные  плюрипотентные стволовые (ИПС)  клетки от  пациентов с спорадической  формой  БП и  здоровых лиц. Полученные ИПС клетки охарактеризованы по морфологическим, цитогенетическим и молекулярно-биологическим критериям и  показно,  что все отобранные линии клеток имели нормальный набор хромосом и экспрессировали маркеры плюрипотентности, характерные для эмбриональных стволовых клеток человека. Разработан протокол нейрональной дифференцировки ИПС клеток in vitro, с использованием которого  из всех линий ИПС клеток получены нейросферы, нейрональные предшественники и морфологически зрелые терминально дифференцированные нейроны от пациентов с БП и неврологически здоровых лиц.

Разработана  комбинированная модель для изучения патогенеза БП и поиска новых перспективных лекарственных средств для терапии данного заболевания, которая состоит из двух основных блоков - блока in vitro, основанного на использовании ИПС клеток и их производных на разных этапах дифференцировки в нейрональные клетки и дофаминэргические нейроны, и блока in vitro, основанного на получении крыс с токсической моделью БП и анализе их поведения с использованием набора тестов. Валидация экспериментальной модели БП    с использованием панели веществ, обладающих нейропротекторными свойствами,  показала,  что  модельные системы in vitro и in vivo оказываются чувствительными к действию соединений с ранее показанной нейропротективной активностью. Это позволяет проводить быстрый скрининг вновь разрабатываемых соединений в двухэтапном формате - на первом этапе тестируется влияние этих соединений на выживаемость культивируемых нейрональных клеток in vitro, а на втором этапе соединение тестируется в системе in vivo на крысах с 6-ГДА моделью заболевания.

На  основании   структуры  природных  регуляторных  пептидов  и  ранее  полученных  при  изучении    обладающих  нейропротекторной  активностью  пептидов была сформирована группа из более 300 пептидов, представляющих интерес в качестве кандидатных пептидов для создания лекарственных препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний. 10    потенциально обладающих нейропротективными свойствами пептидов  размером  от 3  до  8  аминокислотных  остактов  синтезированы,  очищены  и в  настоящее  время   тестируются в    разработанной комбинированной  модели   этиопатогенеза   болезни  Паркинсона.

 

Практическая значимость исследования
Область применения - скрининг соединений различной химической природы для выявления потенциальных нейропротекторов и оценки уровня их нейропротекторной активности в системе in vitro на основе ИПС клеток и в системе in vivo на основе токсической модели нейродегенеративного заболевания. На основании этого скрининга может быть сформирована панель нейропротекторов для дальнейшего анализа возможности их клинического применения при лечении нейродегенеративных заболеваний и могут быть разработаны методы массового производства этих нейропротекторов для проведения клинических исследований данных соединений и отбора наиболее клинически эффективных нейропротекторов. Кроме этого, будут выявлены транскрипционные маркеры ранней клинической стадии болезни Паркинсона у человека, которые могут послужить основой для разработки методов диагностики данного заболевания на доклинической стадии.