Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0061

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0061
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Название доклада
Разработка адресного терапевтического cредства для лечения костных метастазов опухолей на основе бифосфонатов и белков-цитокинов
Докладчик
Даниленко Елена Дмитриевна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целью проекта является разработка методов получения противоопухолевого препарата направленного действия на основе фактора некроза опухоли альфа, интерферона гамма и бифосфоната алендроновой кислоты– прототипа принципиально нового лекарственного средства для лечения костных метастазов.
Задачи исследования:
-разработка методов получения конъюгатов рекомбинантных ФНО-α и ИФН-γ человека с алендроновой кислотой (АЛН);
-разработка методов получения молекулярных конструкций, содержащих ФНО-α (ИФН-γ) и АЛН;
-исследование тропности конъюгатов и конструкций к аналогу минерального матрикса костной ткани in vitro;
-изучение накопления конъюгатов и конструкций в экспериментальных опухолевых метастазах костей;
-получение композиций конъюгатов ФНО-α и ИФН-γ с АЛН, и конструкций, содержащих ФНО-α, ИФН-γ и АЛН;
-исследование противоопухолевой и антирезорбтивной активности конъюгатов, конструкций и их композиций на экспериментальной модели костных метастазов.
Актуальность и новизна исследования
Актуальность исследования обоснована остротой проблемы терапии метастазирующих опухолевых заболеваний. По данным статистики, у 60% из впервые выявленных больных в нашей стране наблюдаются запущенные формы злокачественных опухолей с очагами метастазирования (Чиссов В.И. с соавт., 2009). Скелет является третьей по частоте локализацией метастатического поражения после легких и печени. Наличие костных метастазов приводит к значительному ухудшению качества жизни онкологических больных за счет развития у них различных осложнений (болевой синдром, патологические переломы, компрессия спинного мозга и др.) (Стенина М.Б. с соавт., 2010). Лечение метастазов опухолей в костную систему в настоящее время основано на использовании цитостатиков, эффективность которых невелика в силу особенностей локализации очагов и их труднодоступности. Поэтому поиск способов и средств лечения костных метастазов для удлинения и улучшения качества жизни онкологических больных чрезвычайно актуален.
Новизна исследования заключается как в выборе в качестве активных компонентов нового препарата белков- цитокинов ФНО-α и ИФН-γ, так и способе их направленной доставки в патологический очаг кости. Помимо противоопухолевых свойств, ФНО-α и ИФН-γ обладают способностью регулировать ремоделирование костной ткани, что может быть важно для торможения костной резорбции, индуцированной ростом опухоли. Способ адресной доставки цитокинов в патологический очаг кости основан на использовании в качестве векторной молекулы, отличающейся повышенной тропностью к костной ткани, бифосфоната алендроновой кислоты.

Описание исследования

Для решения поставленных задач были использованы два методических подхода. Первый заключался в получении конъюгатов аминосодержащего бифосфаната (алендроновой кислоты) с белками-цитокинами. Методы ковалентного присоединения цитокинов к различным носителям (монометоксиполиэтиленгликоль, полиглюкин, поливинилпирролидон, дивиниловый эфир)  в настоящее время активно используются и  хорошо описаны (Kamada H. Et al., 2000; Li Y.-P. et al., 2001; Шмелев В.А., 2008). Исследованы и некоторые стратегии конъюгирования бисфосфонатов с лекарственными средствами (Herczegh P. et al., 2002; Doschak M.R. et al., 2009; Hirabayashi H. et al., 2001; Ora M. et al., 2008). Конъюгаты между бифосфанатами и белками в рамках данного проекта получали как результат межмолекулярных сшивок с использованием водорастворимого карбодиимида и двух типов бифункциональных сшивающих агентов, глутарового альдегида и сульфосукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилата. 

Второй методический подход состоял в  получении наночастиц,которые могли бы служить переносчиками молекул цитокинов и бифосфаната. Работы по созданию транспортных форм фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α) в виде неорганических наночастиц, синтетических полимеров, липосом ведутся во многих странах мира (Visaria R.K. et al., 2006; Farma J.M. et al., 2007; Messerschmidt S.K. et al., 2009).  Авторами данного проекта разработаны способы получения конструкций,  представляющих собой наночастицы, ядро которых образовано двуспиральной РНК, покрытой полисахаридной оболочкой, а на поверхности экспонированы молекулы ФНО-α или ИФН-γ (Лебедев Л.Р. и др, 2000; Гамалей С.Г. и др., 2010; Korovina O.S. et al., 2013). Данный подход был использован для получения наночастиц на основе  белков-цитокинов  и алендроновой кислоты. 

Оценку интактности структуры и биологических свойств ФНО-α и ИФН-γ в составе конъюгатов и конструкций проводили методами хроматографии, электрофореза, иммуноферментного анализа, в цитолитических тестах на культурах клеток L929 и L-68. Наличие в препаратах конструкций наночастиц подтверждали  методами электронной микроскопии и динамического светорассеяния. Исследование способности конъюгатов и конструкций, несущих ФНО-α или ИФН-γ и алендроновую кислоту, связываться с костной тканью in vitro оценивали хроматографическим методом на колонке с гидроксилапатитом,  аналогом минерального матрикса костной ткани. Уровень накопления белков в экспериментальных костных  метастазах лимфолейкоза L120/1  анализировали иммуноферментным методом. Оценку противоопухолевой и антирезорбтивной активности конъюгатов и конструкций, несущих ФНО-α, ИФН-γ и алендроновую кислоту, а также их композиций  проводили на экспериментальной модели костных метастазов мышей, индуцированных внутрисердечным введением клеток меланомы B16-F10, с использованием гистологических методов. 

Результаты исследования

Разработаны оригинальные методы синтеза конъюгатов ФНО-α и ИФН-γ с алендроновой кислотой на нерастворимом носителе с использованием (1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида, сульфосукцинмидил-4-[N-малеимидометил]-циклогексан-1-карбоксилата (Sulfo-SCMM) и глутарового альдегида. Показано, что отработанные методы позволяют получать конъюгаты с заданной  стехиометрией, высокой чистоты и гомогенности. Исследования физико-химических и биологических свойств конъюгатов подтвердили сохранность конформационных свойств белков и высокий уровень их специфической активности. Оформлены Методики синтеза конъюгатов алендроновой кислоты с ФНО-α или ИФН-γ.

Отработаны условия сборки молекулярных конструкций на основе конъюгатов ФНО-α, ИФН-γ и алендроновой кислоты с декстраном и двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Установлено, что основным компонентом препарата  конструкции, содержащей ФНО-α и алендроновую кислоту, являются наночастицы размером 25-45 нм. Препарат конструкции, несущей ИФН-γ и АЛН, отличался большей гетерогенностью и содержал частицы диаметром 10-20 и 20-55 нм. Конъюгирование не приводило к серьезным нарушениям структурных и конформационных свойств белков, о чем свидетельствует сохранение  способности к связыванию со специфическими антителами, цитолитической или противовирусной активности,  протеолитической устойчивости. Оформлены Методики синтеза конструкций, содержащих  ФНО-α или ИФН-γ и алендроновую кислоту.

На модели костной ткани in vitro показано, что  как конъюгаты, так и конструкции, несущие ФНО-α, ИФН-γ и алендроновую кислоту, обладают высоким сродством к гидроксилапатиту, аналогу минерального костного матрикса. Полученные конъюгаты ФНО-α и ИФН-γ с алендроновой кислотой, также как конструкция, содержащая ФНО-α и АЛН, отличались повышенной  способностью к накоплению в опухолевой ткани метастазов лимфоцитарного лейкоза L1210/1, по сравнению с исходными белками. 

Получены и охарактеризованы экспериментальные образцы композиционных препаратов, содержащих  конъюгаты ФНО-α и ИФН-γ  с алендроновой  кислотой либо конструкций, несущих ФНО-α, ИФН-γ и АЛН, с разным соотношением компонентов (1:1, 5:1, 10:1, 100:1). 

На экспериментальной модели костных метастазов меланомы B16-F10, индуцированных внутрисердечным введением мышам клеток опухоли,  установлено, что конъюгаты, содержащие ФНО-α, ИФН-γ и алендроновую кислоту, и их композиции обладают противоопухолевой и антирезорбтивной активностью. Наиболее выраженные эффекты были  зарегистрированы после введения конъюгата ФНО-α с алендроновой кислотой (площадь некроза опухолевого метастаза 40-90%) и композиции, содержащей конъюгаты ФНО-α и ИФН-γ с АЛН в соотношении 1:1 (площадь некроза 50-70%).

По результатам выполнения проекта оформлены 5 статей в научных журналах, реферируемых в базах Web of Science и Scopus, 2 заявки на изобретение.

Сопоставление полученных  результатов с данными аналогичных работ за рубежом показывает их соответствие мировому уровню исследований в области создания противоопухолевых препаратов на основе  белков-цитокинов, при этом реализованные подходы отличаются несомненной новизной и патентоспособностью.

Практическая значимость исследования
Областью применения препарата по завершении разработки лекарственного средства для лечения костных метастазов и организации производства нового препарата будет онкологическая практика. Предполагается, что препарат будет использоваться для лечения запущенных форм рака, характеризующихся метастатическим поражением костной системы (рак молочной железы, предстательной железы, почечноклеточный рак и др.). Социальный эффект внедрения препарата в клиническую практику заключается в повышении эффективности лечения онкологической патологии, снижении инвалидизации населения, повышении длительности и качества жизни.Созданный препарат по прогнозным исследованиям будет обладать более высокой противоопухолевой эффективностью в отношении метастатических поражений костей, чем применяемые в настоящее время препараты. Кроме того, он будет отличаться более широким спектром терапевтического действия, проявляющемся в нормализации структуры и архитектоники костных тканей в условиях роста опухолевых метастазов. Подобный препарат в силу своих преимуществ имеет хорошие перспективы стать действенным инструментом в руках онкологов и окажется конкурентоспособным на мировом рынке.
В дальнейшем данные о принципиальной возможности получения белковых препаратов с повышенной тропностью к костной ткани на основе алендроновой кислоты либо других типов бифосфонатов могут быть использованы при разработке новых средств лечения и других видов костных патологий, таких как остепороз, остеопетроз и т.д. Это позволит многократно расширить сферу применения данной разработки.