Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0144

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0144
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологически активных веществ Российской академии наук
Название доклада
Создание научно-технических решений для разработки стимуляторов нейрогенеза
Докладчик
Нинкина Наталья Николаенва
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целью выполнения ПНИ является разработка процесса автоматизации и экспериментальных методик in vitro и in vivo для рационального дизайна и валидации химических веществ, обладающих свойством стимулировать продукцию и выживание новых нейронов во взрослом мозге.
В задачи 4го этапа ПНИ входило оценить пронейрогенную активность целевых соединений и отобрать препараты-лидеры, а также экспериментально валидировать отобранные химические вещества, в исследованиях in vitro и in vivo с использованием разработанных тест-систем. Кроме того, требовалось продолжить работы по разведению и содержанию модельных линий трансгенных мышей, формированию экспериментальных когорт животных и передачи их на эксперимент.
Актуальность и новизна исследования
Боковой амиотрофический склероз (БАС) — это дегенеративное заболевание центральной нервной системы, при котором происходит поражение как верхних, так и нижних мотонейронов, что приводит к параличам и полной атрофии мышц. Для изучения патогенеза бокового амиотрофического склероза, а также создания потенциальной терапии, была создана линия трансгенных мышей THY-1/FUS 1-359, в нейронах которой экспрессируется аберрантная форма белка FUS, патология которого ассоциирована с БАС. У мышей данной линии наблюдается развитие FUS-протеинопатии с последующим повреждением двигательных нейронов и развитием специфической клинической картины заболевания.
В настоящее время в ряде исследовательских лабораторий ведется разработка подходов к терапии заболеваний, характеризующихся прогрессирующей гибелью нейронов центральной нервной системы, в число которых входит БАС. Одним из новых и наиболее перспективных подходов является стимуляция присущего организму способа восстановления утраченных клеток – нейрогенеза. Существуют доказательства того, что процесс нейрогенеза нарушен при ряде нейродегенеративных заболеваниях. Нами было продемонстрировано, что у линии мышей THY-1/FUS 1-359 интенсивность образования новых клеток в нервной системе снижена как в зубчатой извилине гиппокампа, так и в люмбарном отделе спинного мозга. Таким образом, фармакологическое воздействие на эти процессы потенциально может оказывать эффект на развитие заболевания и продолжительность жизни мышей данной линии и может лечь в основу разработки терапии бокового амиотрофического склероза.
Описание исследования

На первом этапе исследования соединения из фокусированной библиотеки были протестированы с использованием ранее разработанной тест-системы in vitro культуры клеток линии SH-SY5Y, экспрессирующих T5 патогенную форму белка TDP43, для оценки их антиагрегационных и нейропротекторных свойств. После синтеза химическая чистота всех тестируемых соединений была предварительно подтверждена на основании данных полученных при их исследовании методом ЯМР (Avance III 500 MHz фирмы Bruker (Германия)) и составила не менее 97%. Для оценки способности веществ оказывать нейропротекторные свойства в условиях образования патологических белковых агрегатов была получена культура клеток линии SH-SY5Y, экспрессирующих T5 патогенную форму белка TDP43. Клетки засевали на обработанные полилизином стекла диаметром 10 мм, помещенные в 24-луночные культуральные планшеты. Плазмидная ДНК, кодирующая Т5 форму, была введена в недифференцированные клетки SH-SY5Y методом транзиторной трансфекции. Через 3 часа после трансфекции к культивируемым клеткам добавляли питательную среду, содержащую исследуемые вещества до конечной концентрации 10 мкг/мл; в контрольные образцы  добавляли среду без препаратов. Через 16 часов клеточные культуры фиксировали и подсчитывали число флюоресцентных включений, размер которых был не менее пяти микрометров. В каждом эксперименте за 100% принимали количество включений в контрольных культурах, которые инкубировались после трансфекции без добавления препаратов.

Для оценки нейропротекторного свойства исследуемых веществ in vitro нами был проведен подсчет числа живых клеток, содержащих флюоресцентный белок, обнаруживаемых на площади 10 000 мкм2 после трансфекции SH-SY5Y культуры плазмидной ДНК, кодирующей Т5 форму белка TDP-43 с последующей обработкой соединениями через 4 и 12 часов после трансфекции.

Тhy-1/FUS 1-359 мыши начиная с возраста 30 дней получали исследуемое вещество с водой ad libitum. В качестве контроля использовались трансгенные мыши, получавшие воду. На пресимптоматической стадии заболевания в возрасте 90 дней мышам вводили 5-бромдезоксиуридин в дозе 50 мкг/г (BrdU, Sigma Aldrich, USA) в 0,9% NaCl, 7-ми дневным курсом и через 30 дней проводили забор биологического материала. Животных подвергали эвтаназии, проводили транскардиальную перфузию 4% раствором PFA и извлекали головной и спинной мозг. Далее выполняли дегидратацию ткани, после чего ткань заключали в парафин. Для приготовления гистологических препаратов, срезы толщиной 8 мкм, полученные на ротационном микротоме, монтировали на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином.  Области, в которых проводилось гистологическое исследование, были определены на основании анатомического картирования, проведённого ранее на стадии пилотного эксперимента. Методом иммуногистохимического окрашивания осуществляли идентификацию BrdU-положительных клеток в соответствующей анатомической области. Подсчет BrdU-положительных ядер проводили при помощи метода фракционирования. Для подтверждения локализации сигнала в ядерном компартменте использовали окраску DAPI.

Для проведения отсеивающего тестирования с целью отобрать препараты-лидеры из того пула соединений, что был выделен при первичном скрининговом исследовании на культуре клеток SH-SY5Y (T5-TDP43), был использован следующий алгоритм: на первом этапе отбора все 10 препаратов были протестированы на способность оказывать пронейрогенный эффект в мышах Тhy-1/FUS 1-359 с использованием наименее допустимого числа животных в экспериментальных группах с условием получения надежного результата. При обнаружении положительного эффекта количество животных в группе увеличивается (проводятся дополнительные исследования) и при условии подтверждения предварительных данных доводиться до избыточного (12 животных в группе) для получения максимально надежных и воспроизводимых результатов. Такой подход позволяет исключить получение ложноположительных результатов, что является наиболее нежелательным событием при тестировании и отборе потенциальных лекарственных препаратов, так как все вещества показавшие эффект на первых стадиях тестирования на небольшой выборке проходят дополнительные детальные исследования с использованием больших выборок, в то время как ложно отрицательные результаты не несут такой опасности, вещество, не показавшее эффект на первых стадиях тестирования, отсеивается, что не несет за собой дальнейших ресурсных затрат на его исследование. 

Результаты исследования

В результате сравнения количества BrdU+ клеток, обнаруженных в зубчатой извилине гиппокампа по прошествии 30 дней после введения BrdU у трансгенных мышей, получавших препараты, с трансгенным контролем, было выявлено, что из 10 протестированных соединений наибольший эффект имеют следующие: Димебон (количество выживших клеток увеличено на 35% по сравнению с Тhy-1/FUS 1-359 мышами, не получавшими препаратов), DF-302 (57%), DF-312 (41%) и DF-328 (24%). В люмбарном отделе спинного мозга соединения проявили аналогичную активность, при том наибольший эффект был достигнут при применении следующих соединений: Димебон (26%), DF-302, DF-312, DF-328.

Для того, чтобы оценить наиболее вероятный механизм действия веществ, была использована пульсовая схема введения BrdU. При этом в отличии от курсового введения BrdU вводили однократно, 150 мкг/г (BrdU, Sigma Aldrich, USA) в 0,9% NaCl, в возрасте 96 дней, а забор материала осуществляли через 24 часа.

Было выявлено, что вещества DF-312 и DF-318 в наибольшей степени способствуют усилению пролиферации нейрональных предшественников в зубчатой извилине гиппокампа (количество генерированных клеток в обоих случаях увеличено на 21% по сравнению с Тhy-1/FUS 1-359 мышами, не получавшими препаратов), однако Димебон и DF-302 показал лишь слабый эффект (13% для обоих соединений). При этом DF-328 способствовал снижению количества BrdU+ клеток в зубчатой извилине гиппокампа трансгенных мышей на 17% . В спинном мозге увеличение количества BrdU+ клеток было выявлено при введении Димебона и DF-312 (23% и 31% соответственно). При этом слабый эффект также отмечался при введении DF-301 и DF-328 (17% для обоих веществ).

В результате предварительной оценки пронейрогенной активности целевых соединений было принято решение отобрать в качестве препаратов-лидеров соединения Димебон, DF-302 и DF-312, так как они оказали наибольшее влияние на выживаемость клеток, образованных в пронейрогенных зонах нервной системы Тhy-1/FUS 1-359 мышей. При этом соединение DF-328, которое также положительно влияло на выживаемость, было исключено из дальнейших исследований, поскольку оно способствовало снижению пролиферации нейрональных прекурсоров в зубчатой извилине гиппокампа.

По результатам исследований был подтвержден эффект, оказываемый данными веществами на выживаемость клеток в зубчатой извилине гиппокампа и люмбарном отделе спинного мозга. Так, эффект Димебона на выживаемость клеток в зубчатой извилине и люмбарном отделе спинного мозга составил 35% и 37% соответственно. При этом, Димебон не влияет на пролиферативную активность клеток в данных анатомических зонах.

Примечательно, что соединение DF-302 оказывало более выраженный эффект на выживаемость клеток в зубчатой извилине гиппокампа (60%) по сравнению с Димебоном, однако в люмбарном отделе спинного мозга данный показатель увеличивался лишь на 26%. Статистически достоверного эффекта на пролиферацию клеток DF-302 также не оказывало.

Влияние соединения DF-312 на выживаемость клеток в пронейрогенных зонах сопоставимо с таковым для Димебона и составляет 32% и 37% для зубчатой извилины и люмбарного отдела спинного мозга соответственно. Как и для других соединений ряда гамма-карболинов, отобранных из фокусированной библиотеки, DF-312 не влияло на уровень пролиферативной активности в исследуемых зонах.

Практическая значимость исследования
Развитие как острых, так и медленнотекущих нейродегенеративных заболеваний сопровождается массовой гибелью клеток нервной системы. Необходимым компонентом комплексной терапии НДЗ представляется репарация поврежденных или уже утерянных клеточных структур, что теоретически может быть достигнуто стимуляцией регенеративных процессов в нейрогенных зонах мозга. Ведутся активные исследования [Pieper A.A. et al., 2010] по разработке соединений, способных стимулировать пролиферацию и дифференцировку нейрональных клеток в субвентрикулярной зоне и зубчатой фасции взрослого мозга для лечения распространенных НДЗ, таких как болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз и др. Известно, что соединения производные гамма-карболина и карбазола, оказывают нейропротекторный и пронейрогенный эффект и препятствуют гибели клеток в нервной системе животных моделирующих нейродегенеративные заболевания человека [De Jesus-Cortes H. et al., 2012].
В ходе предыдущих этапов исследований была сформирована фокусированная библиотека из 43 потенциальных химических веществ с нейропротекторными и пронейрогенными свойствами, а также разработана методика для анализа пронейрогенной и нейропротекторной активности химических соединений. Часть перспективных вновь синтезированных соединений была защищена патентом. Задача данного этапа состояла в оценке пронейрогенной активности целевых соединений и отборе препаратов-лидеров с наиболее выраженными пронейрогенными свойствами, а также в валидации отобранных химических веществ.
В результате проделанной в рамках 4 этапа работы с помощью методик, разработанных в ходе выполнения 3 этапа данного проекта, была выполнена оценка пронейрогенной активности целевых соединений и отбор препаратов-лидеров среди соединений, синтезированных в рамках 2 этапа. Проведена экспериментальная валидация отобранных химических веществ, в исследованиях in vitro и in vivo с использованием разработанных тест-систем. Продолжены работы по разведению и содержанию модельных линий трансгенных мышей, формированию экспериментальных когорт животных и передаче их на эксперимент.
Постер

Poster_Ninkina.ppt