14.628.21.0001

Цели реализуемого проекта: 1) создание штаммов-продуцентов новых и улучшенных ксилоглюканаз для более полной и эффективной конверсии растительной биомассы в продукты с высокой добавочной стоимостью, на базе промышленно-значимых микробных платформ, с использованием природного биоразнообразия и передовых подходов генетической инженерии 2) выполнение ФГУП «ГосНИИгенетика» международных обязательств, зафиксированных в Договоре о сотрудничестве с Мюнхенским техническим университетом, относящемся к совместному проекту в рамках Российской Федеральной Целевой Программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы» мероприятия 2.2 «Исследования связанные с созданием научно-технического задела в области промышленной биотехнологии/биоэкономики с участием научно-исследовательских организаций и университетов Федеративной Республики Германии» и второго мероприятия Международная Биоэкономика: Глобальная кооперация для Био-ориентированной Экономики, Модуль 2 «Био-Ге-Ру» Федерального Министерства образования и научных исследований Германии, соответственно.
В задачи работы входят: поиск и клонирование генов новых ксилоглюканаз, источником которых служат неисследованные ранее штаммы термофильных грибов из коллекции ВКПМ; гетерологичная экспрессия генов новых ксилоглюканаз в Pichia pastoris; характеристика полученных штаммов и новых рекомбинантных ксилоглюканаз, исследование продуктов гидролиза ксилоглюкана новыми рекомбинантными ксилоглюканазами.

Ксилоглюкан (КГ) – один из основных структурных полисахаридов первичной клеточной стенки первого типа, которой обладают все двудольные и значительная часть однодольных растений. КГ и пектины формируют матрикс, в который погружены микрофибриллы целлюлозы, образующие каркас клеточной стенки. Эффективный гидролиз ксилоглюканового матрикса – необходимое условие для последующей полной деградации растительной биомассы до сахаров. В семенах некоторых растений (Tamarindus indica, Tropaeolum majus) КГ выполняет запасающую функцию и может служить ценным источником сахаров для микробной ферментации и разнообразных олигосахаридов для пищевой и кормовой промышленности, производства пищевых добавок и фармацевтики. Различные виды грибов участвуют в биодеградации природной растительной биомассы и продуцируют широкий спектр гликозил-гидролаз, включая ксилоглюкан-специфические эндо-β-1,4-глюканазы (EC 3.2.1.151), ксилоглюкан-специфические экзо-β-1,4-глюканазы (EC 3.2.1.155) и экзо-ксилоглюканазы типа OXG-RCBH (oligoxyloglucan reducing-end-specific cellobiohydrolase, EC 3.2.1.150). Особый интерес вызывают термофильные штаммы, продуцирующие термостабильные ферменты. Исследование свойств ферментов и механизмов гидролиза КГ необходимо для повышения эффективности процессов переработки растительного сырья.
Новизна исследований заключается в том, что источником ксилоглюканаз служат ранее не исследованные штаммы термофильных грибов, способных к биодеградации растительной биомассы. Новые ксилоглюканазы будут конкурентоспособны по сравнению с существующими отечественными и зарубежными аналогами и могут быть использованы в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства.

В рамках работ по проекту выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей проблему исследования ксилоглюканов и гидролизующих их ферментов и проведены патентные исследования; произведен выбор направления исследований, в том числе проведена сравнительная оценка микробных продуцентов промышленно значимых ксилоглюканаз; выполнено обоснование и проведен выбор оптимального варианта исследований. Разработана Программа экспериментальных исследований по созданию и оценке рекомбинантных штаммов-продуцентов ксилоглюканаз и по характеристике новых ксилоглюканаз. Разработаны методики получения микробных штаммов-продуцентов ксилоглюканаз, оценки продуктивности микробных штаммов-продуцентов ксилоглюканаз, оценки функциональной активности рекомбинантных ксилоглюканаз.

С целью поиска штаммов, гидролизующих ксилоглюкан, проведен скрининг Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), содержащей 607 различных, в том числе и природных, грибных штаммов. Ксилоглюканазная активность выявлена в штаммах микроскопических грибов, способных к биодеградации растительной биомассы. Приоритетным стал поиск термостабильных ферментов, поэтому в результате скрининга были выбраны штаммы, обладающие природной способностью к гидролизу ксилоглюкана при повышенной температуре (40-45 °С). Выбранные штаммы были охарактеризованы и оценены по уровню ксилоглюканазной активности, температурному и pH оптимуму и термостабильности нативных ксилоглюканаз. Гены термостабильных ксилоглюканаз, принадлежащих к разным семействам гликозилгидролаз обнаружены в геномах выбранных штаммов с помощью сочетания методов электрофореза в денатурирующих условиях, зимографии и масс-спектрометрии. 

Штаммы-продуценты сконструированы на базе промышленно-значимой микробной платформы Pichia pastoris, наиболее подходящей для получения рекомбинантных промышленных продуцентов грибных ферментов. Последовательность кандидатного гена, кодирующего ксилоглюканазу семейства GH74 из штамма Myceliophthora thermophila, оптимизирована для экспресии в P. pastoris путем удаления интронов и замены кодонов. Синтетический ген интегрирован в хромосому штамма P. pastoris GS115 и экспрессирован под контролем эффективного метанол-индуцируемого AOX-промотора. Биосинтез целевого фермента проведен путем ферментации рекомбинантного штамма на среде с метанолом. Препараты рекомбинантных ксилоглюканаз получены путем концентрирования культуральной жидкости с последующим диализом. Оценку функциональной активности ксилоглюканаз проводили в препаратах культуральной жидкости рекомбинантных штаммов путем исследования субстратной специфичности, определения ферментативной активности на ксилоглюкане и других субстратах, исследования диапазона и оптимума рН и температуры, определения термостабильности. Гликозилирование ферментов исследовали путем сравнительного анализа продуктов трипсинолиза с помощью масс-спектрометрии, а также путем обработки гликопротеинов ферментом EndoH. Проведено исследование зависимости активности рекомбинантных ферментов от ионов металлов. Проведен биосинтез рекомбинантных ксилоглюканаз во флаконах и биореакторе, исследованы длительность ферментации, выход целевого продукта, удельная активность целевого фермента в культуральной жидкости при ферментации во флаконах и в биореакторе. Характеристику рекомбинантных ксилоглюканаз проводили с использованием ксилоглюкана из семян тамаринда, для получения которого использовали методы ступенчатой экстракции полисахаридов из растительного сырья. Исследование механизма действия ферментов проводили путем анализа кинетики образования продуктов гидролиза методами высокоэффективной ионообменной хроматографии, тонкослойной хроматографии. Идентификацию олиго- и моносахаридов, образовавшихся в результате гидролиза ксилоглюкана рекомбинантными ферментами, проводили путем масс-спектрометрии. В ходе работы использованы классические методы микробиологии, молекулярной биологии, биохимии. В результате получены высокоэффективные рекомбинантные штаммы-продуценты ксилоглюканаз с улучшенными свойствами. Новые термостабильные ферменты могут быть использованы для полного гидролиза ксилоглюкана в составе растительной биомассы.

В процессе выполнения проекта выполнен скрининг грибной коллекции ВКПМ. Выбраны термофильные штаммы Sporotrichum pruinosum, Thielavia terrestris, Sporotrichum thermophile и Myceliophthora thermophila, гидролизующие ксилоглюкан при температуре 40-45 °С. Проведена оценка перечисленных штаммов по уровню ксилоглюканазной активности, температурному и pH оптимуму и термостабильности нативных ксилоглюканаз. Ген, кодирующий ксилоглюканазу семейства GH74 из M. thermophila, изолирован, отсеквенирован и выбран в качестве кандидатного; его нуклеотидная последовательность оптимизирована для эффективной экспрессии в Pichia pastoris. На основе вектора для интегративной экспрессии в Pichia получена конструкция, содержащая синтетический ген mt74sin. Проведена трансформация штамма Pichia pastoris GS115 интегративной конструкцией. Выполнена селекция трансформантов P. pastoris/mt74sin, проведен отбор клонов по уровню внеклеточной ксилоглюканазной активности, в результате чего выбраны наилучшие рекомбинантные продуценты ксилоглюканазы. При культивировании во флаконах и биореакторе величина ксилоглюканазной активности в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов составила ~90 Ед./мл и 120 Ед./мл, соответственно. Для сравнения, ксилоглюканазная активность исходного штамма M. thermophila составила 1,17 Ед./мл. 50% ферментативной активности рекомбинантной ксилоглюканазы сохраняется в диапазоне рН 4.5-9.0 и в диапазоне температур 55-85°С. рН оптимум составляет 6.5; максимум активности фермент проявляет при 70°С. Фермент сохраняет стабильность после инкубации в течение ночи в диапазоне рН 3.5-10.0 и после 30 мин при 60°С. Полученные рекомбинантные штаммы производят не менее 3 г/л целевого продукта, доля которого в общем содержании внеклеточных белков по данным денситометрии составляет не менее 40 %.

Выделены ксилоглюканы из тамаринда индийского, яблони домашней, настурции большой; определены структурные типы полученных ксилоглюканов. Проведен гидролиз КГ из тамаринда новыми рекомбинантными ксилоглюканазами из P. pastoris/mt74sin, исследована кинетика образования продуктов гидролиза и определен их качественный состав. На основании полученных данных сделан вывод, что рекомбинантные ксилоглюканазы из P. pastoris являются эндоксилоглюканазами и расщепляют цепь КГ на стандартные моноблоки XXXG, XXLG(XLXG) и XLLG, а также способны гидролизовать моноблоки ксилоглюкана до более коротких олигосахаридов.

Предсказаны четыре потенциальных сайта N-гликозилирования рекомбинантных ксилоглюканаз в P. pastoris. Проведен гидролиз гликопротеинов ферментом EndoH, в результате чего показано, что гликозилирование ксилоглюканаз происходит только по одному сайту.

Высокоэффективные рекомбинантные штаммы P. pastoris могут быть использованы в качестве продуцентов термостабильной ксилоглюканазы. Новые ферменты будет использованы для получения ксилоолигосахаридов, а также для гидролиза растительной биомассы.

Экономическая значимость проекта состоит в расширении арсенала высокопродуктивных штаммов-продуцентов гликозилгидролаз, обладающих высокой специфической активностью и предназначенных для высокоэффективной деструкции природного растительного сырья, отходов его промышленной и сельскохозяйственной переработки, гидролиза растительных полисахаридов с целью последующего использования продуктов гидролиза в биотехнологических процессах получения продуктов с высокой добавочной стоимостью. Новые ксилоглюканазы, обладающие промышленно-важными свойствами могут быть использованы в целлюлозно-бумажной, текстильной промышленности, для приготовления кормов для животных, пищевых добавок, в составе ферментных комплексов для конверсии растительной биомассы, а также для ступенчатого гидролиза олигосахаридов с целью их структурного анализа либо получения специфических моносахаридов. Понимание механизма гидролиза КГ играет центральную роль в усилении ферментативного процесса деградации растительной биомассы. Кроме того, исследование ферментов, гидролизующих КГ, необходимо для разработки способов защиты растений от патогенных микроорганизмов, использующих ксилоглюканазы для проникновения в растительную клетку.