14.613.21.0036
Модельным объектом являются эмбрионы плодовой мушки Drosophila melanogaster на ранней стадии развития (до гаструляции). Наиболее удобной стадией для визуализации флуоресценции в динамике является стадия после 14 деления ядра до гаструляции, которая длится приблизительно 50 минут. В течение данного времени можно получить большое количество данных о транскрипционной активности исследуемого гена. Кроме того, на этой стадии приблизительно 6000 ядер распределены равномерно близко к поверхности оболочки и не отграничены клеточными стенками, что значительно снижает уровень фона, а также дает возможность осуществить хороший статистический анализ данных.
Локусы генома метятся либо эндогенно с помощью методики CRISPR, либо изучается механизм транскрипции введением дополнительной конструкции экзогенно. Репортерная система подразумевает введение 24 копий последовательности MS2 в геном, при транскрипции образуются молекулы РНК, формирующие структуры в виде шпилек, связывающие белок MCP-GFP. Вторая репортерная система основана на идентичном механизме с применением последовательности PP7 и PCP-RFP белка. Кроме того, возможно пометить локус ДНК независимо от транскрипции введением последовательности parS, которая перманентно связывается с parB белком.
Для изучения механизма энхансер-промоторных взаимодействий необходимо было протестировать основной тезис, согласно которому, несмотря на большое расстояние между энхансером и промотором в геноме, физическое расстояние между энхансером и промотором может сокращаться за счет образования хроматином петли, в результате чего активируется сайт транскрипции. Таким образом, мечение промотора одним цветом (MS2), энхансера другим цветом (PP7), а также область, лежащую рядом с промотором (parS/parB) позволяет создать трехцветную флуоресценцию. Сближение двух цветов должно оказывать влияние на частоту возникновения третьего, что будет свидетельствовать об образовании петли хроматина.
Кроме того, для осуществления корреляционного анализа флуоресценции, который позволит извлечь кинетические параметры транскрипции и в дальнейшем оценку различных факторов на эти параметры, необходимо получить абсолютные значение светимости, протестировав набор различного числа копий MS2 и PP7 последовательностей для построения калибровочной кривой. Абсолютные значения используются в качестве референсных при проведении корреляционного анализа.
Для изучения механизма взаимодействия энхансера и промотора и их возможного сближения вследствие формирования петли хроматина, промоторная область гена even skipped была помечена MS2 последовательностью, энхансер even skipped stripe 2 под промотором snail, находящийся на различном расстоянии от 1 тысячи пар нуклеотидов до 40 тысяч — последовательностью PP7, хроматин в области промотора — parS/parB системой. Удалось обнаружить, что частота возникновения флуоресценции от промоторной области гена even skipped достоверно зависит от расстояния между промотором и энхансером (расстоянии двух флуоресцентных меток PP7 и parS), то есть, действительно, происходит сближение участков хроматина и впервые это продемонстрировано прямым методом визуализации. Кроме того, интенсивность транскрипции зависит также и от близости расположения энхансера в геноме — чем ближе энхансер находится от промотора, тем чаще образуется петля и последующая активация транскрипции. В качестве контроля использовалась конструкция, содержащая инсуляторные элементы Homie и Nhomie, блокирующие энхансерную активность.
Для получения абсолютных значений светимости MS2 и PP7, были созданы генетические конструкции, несущие различное число копий от 8 до 48 данных последовательностей, которые также несли ген lacZ под минимальным hunchback промотором. Измерения показали, что зависимость интенсивности от количества копий не является линейной.
Кроме того, измерена транскрипция гена AbdB в динамике, который участвует в формировании абдоминальных сегментов дрозофилы. Для изучения механизма взаимодействия энхансера с промотором данного гена энхансер iab5 расположили upstream и downstream от промотора на различное расстояние и пометили PP7 репортерной системой. В настоящее время осуществляется анализ данных и обсуждается участие элементов ответа поликомба (PRE) в экспрессии гена и формировании петли хроматина.
Часть измерений флуоресценции в динамике в эмбрионах дрозофилы осуществлялись с применением LLSM микроскопа, что сделано впервые на данном объекте.