14.613.21.0036

Целью исследования является разработка метода визуализации геномных процессов на основе флуоресцентной микроскопии. Модельным объектом являются эмбрионы дрозофилы, несущие встроенные последовательности ДНК при транскрипции которых наблюдается флуоресценция. Требуется подобрать оптимальные условия мечения локусов ДНК для уменьшения фона, улучшить характеристики флуоресцентного LLSM микроскопа, использовать разработанный метод для исследования энхансер-промоторных взаимодействий в геноме дрозофилы.

Экспрессия генов определяется рядом факторов, и в частности, фактическим расстоянием промотора гена от регулирующей энхансерной области. Расстояние в геноме между энхансером и промотором может достигать миллионов пар оснований, однако физическое расстояние может быть небольшим, что достигается за счет образования петли в хроматине. Близость энхансера к промотору можно наблюдать таким методом, как 3C и его различные модификации. Однако данный метод является косвенным и не несет никакой информации о динамике взаимодействия, которое может быть очень кратковременным. В настоящий момент ведутся работы по применению флуоресцентной микроскопии для визуализации данных взаимодействий в динамике (live imaging). Нашими коллегами в Принстоне получены данные о механизме переключения между энхансерами, о частоте взаимодействия энхансера с промотором в зависимости от расстояния и т.д. Однако эти сведения получены с помощью конфокального микроскопа, который не обладает значительным разрешением. В сотрудничестве с ними мы хотим достигнуть более высокого разрешения, при этом сохраняя возможность вести скоростную съемку и без повреждения образца на протяжении длительного времени. Таким решением может быть недавно разработанная LLSM микроскопия, скомбинированная с 2-фотонным микроскопом. Более высокое разрешение позволит получить кинетические параметры исследуемого объекта (геном дрозофилы на стадии эмбриона) и, следовательно, новые сведения о механизме регуляции экспрессии генов, которые могут быть использованы в дальнейшем в самых различных отраслях от биотехнологии до фармакологии и персонализированной медицины.

Модельным объектом являются эмбрионы плодовой мушки Drosophila melanogaster на ранней стадии развития (до гаструляции). Наиболее удобной стадией для визуализации флуоресценции в динамике является стадия после 14 деления ядра до гаструляции, которая длится приблизительно 50 минут. В течение данного времени можно получить большое количество данных о транскрипционной активности исследуемого гена. Кроме того, на этой стадии приблизительно 6000 ядер распределены равномерно близко к поверхности оболочки и не отграничены клеточными стенками, что значительно снижает уровень фона, а также дает возможность осуществить хороший статистический анализ данных.

Локусы генома метятся либо эндогенно с помощью методики CRISPR, либо изучается механизм транскрипции введением дополнительной конструкции экзогенно. Репортерная система подразумевает введение 24 копий последовательности MS2 в геном, при транскрипции образуются молекулы РНК, формирующие структуры в виде шпилек, связывающие белок MCP-GFP. Вторая репортерная система основана на идентичном механизме с применением последовательности PP7 и PCP-RFP белка. Кроме того, возможно пометить локус ДНК независимо от транскрипции введением последовательности parS, которая перманентно связывается с parB белком.

Для изучения механизма энхансер-промоторных взаимодействий необходимо было протестировать основной тезис, согласно которому, несмотря на большое расстояние между энхансером и промотором в геноме, физическое расстояние между энхансером и промотором может сокращаться за счет образования хроматином петли, в результате чего активируется сайт транскрипции. Таким образом, мечение промотора одним цветом (MS2), энхансера другим цветом (PP7), а также область, лежащую рядом с промотором (parS/parB) позволяет создать трехцветную флуоресценцию. Сближение двух цветов должно оказывать влияние на частоту возникновения третьего, что будет свидетельствовать об образовании петли хроматина.

Кроме того, для осуществления корреляционного анализа флуоресценции, который позволит извлечь кинетические параметры транскрипции и в дальнейшем оценку различных факторов на эти параметры, необходимо получить абсолютные значение светимости, протестировав набор различного числа копий MS2 и PP7 последовательностей для построения калибровочной кривой. Абсолютные значения используются в качестве референсных при проведении корреляционного анализа.

Для изучения механизма взаимодействия энхансера и промотора и их возможного сближения вследствие формирования петли хроматина, промоторная область гена even skipped была помечена MS2 последовательностью, энхансер even skipped stripe 2 под промотором snail, находящийся на различном расстоянии от 1 тысячи пар нуклеотидов до 40 тысяч — последовательностью PP7, хроматин в области промотора — parS/parB системой. Удалось обнаружить, что частота возникновения флуоресценции от промоторной области гена even skipped достоверно зависит от расстояния между промотором и энхансером (расстоянии двух флуоресцентных меток PP7 и parS), то есть, действительно, происходит сближение участков хроматина и впервые это продемонстрировано прямым методом визуализации. Кроме того, интенсивность транскрипции зависит также и от близости расположения энхансера в геноме — чем ближе энхансер находится от промотора, тем чаще образуется петля и последующая активация транскрипции. В качестве контроля использовалась конструкция, содержащая инсуляторные элементы Homie и Nhomie, блокирующие энхансерную активность.

Для получения абсолютных значений светимости MS2 и PP7, были созданы генетические конструкции, несущие различное число копий от 8 до 48 данных последовательностей, которые также несли ген lacZ под минимальным hunchback промотором. Измерения показали, что зависимость интенсивности от количества копий не является линейной.

Кроме того, измерена транскрипция гена AbdB в динамике, который участвует в формировании абдоминальных сегментов дрозофилы. Для изучения механизма взаимодействия энхансера с промотором данного гена энхансер iab5 расположили upstream и downstream от промотора на различное расстояние и пометили PP7 репортерной системой. В настоящее время осуществляется анализ данных и обсуждается участие элементов ответа поликомба (PRE) в экспрессии гена и формировании петли хроматина.

Часть измерений флуоресценции в динамике в эмбрионах дрозофилы осуществлялись с применением LLSM микроскопа, что сделано впервые на данном объекте.

Исследование энхансер-промоторных взаимодействий в геноме откроет перспективы регуляции экспрессии генов. Данная область может иметь очень широкое применение в различных областях, но особенно актуальна для персонализированной медицины с целью таргетного изменения уровня экспрессии определенных генов в определенных клетках в организме человека. Кроме того, разработка новых методов визуализации флуоресценции может стимулировать развитие технологий в области оптики.