Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0112

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0112
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук"
Название доклада
Разработка прототипов генетических конструкций для коррекции митохондриальных дисфункций и методов их введения в клетки
Докладчик
Исакова Елена Павловна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Проект направлен на создание системы поддержания репликации интактного митохондриального генома человека в митохондриях дрожжевых клеток и разработка метода его направленной коррекции с помощью гомологичной рекомбинации с применением искусственно введенного в митохондрии дрожжей белка RecA.
Разработка структуры генетической конструкции на основе природной митохондриаль-ной ДНК человека, реплицирующейся в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica, для коррекции мито-хондриальных дисфункций человека: митохондриальной миопатии с молочно-кислым ацидозом и инсультоподобными эпизодами (MELAS) и миоклональной эпилепсии с синдромом рваных красных волокон (MERRF).
Разработка метода доставки генетической конструкции в митохондрии при помощи использования гомологичной рекомбинации с целью дальнейшей коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF.
Разработка методики оценки эффективности действия разработанной генетической конструкции, предназначенной для коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF с помощью новой клеточной модели на основе дрожжей Yarrowia lipolytica.
Актуальность и новизна исследования
С использованием ранее созданных штаммов Y. lipolytica W29 (pQ-SRUS, Leu36H) и W29 (pQ-SRUS, Lys39H) впервые показано, что:
Введение полноразмерного генома митохондрий человека в клетки Y. lipolytica с дефектами гена Yalif-MT39, кодирующего тРНК-Lys, или гена Yalif-MT36, кодирующего тРНК-Leu, позволяет компенсировать их неспособность расти на средах с сукцинатом в ка-честве единственного субстрата.
Для отбора трансформантов, пригодных в качестве источника нативного генома человека рекомендуется исследование не менее 10 независимых клонов трансформантов.
С применением метода ПЦР в реальном времени в формате Taqman показано, что соотношение копийности геномов человека и Y. lipolytica в трансформантах W29 (pQ-SRUS, Leu36H) и W29 (pQ-SRUS, Lys39H) с отбором по описанной выше методике приво-дит к установлению соотношения концентраций геномов 1:2 – 1:4 в пользу генома Y. lipolytica.
Впервые показана возможность отбора культивируемых мезенхимальных стромальных клеток человека, получаемых из липосапирата подкожной жировой клетчатки, с восстановленной функцией митохондрий за счёт введения ДНК, со скорректированными мутациями A3243G и A8344G из рекомбинантных линий Y. lipolytica W29 (pQ-SRUS, Leu36H) и W29 (pQ-SRUS, Lys39H). Для проведения трансфекции необходимо использование реагента Lipofectamin 3000, а для селекции трансфектантов – процедура переноса культуры клеток из условий гипоксии (содержание кислорода 5%) при нормальном содержании фетальной сыворотки в среде в условия нормоксии при сниженном содержании фетальной сыворотки в среде с добавлением в нее сукцината.

Описание исследования

С использованием ранее созданных штаммов Y. lipolytica W29 (pQ-SRUS, Leu36H) и W29 (pQ-SRUS, Lys39H) на четвертом (отчётном) этапе ПНИ впервые показано, что:

1)Введение полноразмерного генома митохондрий человека в клетки Y. lipolytica с дефектами гена Yalif-MT39, кодирующего тРНК-, или гена Yalif-MT36, кодирующего тРНК-, позволяет компенсировать их неспособность расти на средах с сукцинатом в качестве единственного субстрата.

2)Потеря случайно выбранного маркера митохондриального генома человека при получении и отборе трасформантов происходит с вероятностью 15-25%, что требует определения полной последовательности митохондриального генома человека в поддерживающих его рекомбинантных штаммах дрожжей. Для отбора трансформантов, пригодных в качестве источника нативного генома человека рекомендуется исследование не менее 10 независимых клонов трансформантов.

3)С применением метода ПЦР в реальном времени в формате показано, что соотношение копийности геномов человека и Y. lipolytica в трансформантах 29 (-, 36) и 29 (-, 39) с отбором по описанной выше методике приводит к установлению соотношения концентраций геномов 1:2 – 1:4 в пользу генома Y. lipolytica.

4)Впервые показана возможность отбора культивируемых мезенхимальных стромальных клеток человека, получаемых из липосапирата подкожной жировой клетчатки, с восстановленной функцией митохондрий за счёт введения ДНК, со скорректированными мутациями A3243G и A8344G из рекомбинантных линий Y. lipolytica29 (-, 36) и 29 (-, 39). Для проведения трансфекции необходимо использование реагента 3000, а для селекции трансфектантов – процедура переноса культуры клеток из условий гипоксии (содержание кислорода 5%) при нормальном содержании фетальной сыворотки в среде в условия нормоксии при сниженном содержании фетальной сыворотки в среде с добавлением в нее сукцината.

 

Результаты исследования

Предложена интегративная генетическая конструкция pQ-SRUS, предназначенная для введения в клетки экстремофильных дрожжей Yarrowia lipolytica гена RecA из Bacillus subtilis. Условия культивирования рекомбинатного продуцента Yarrowia lipolytica, несущего конструкцию pQ-SRUS, оптимизированы для обеспечения максимального уровня продукции белка RecA. Подобраны оптимальные условия для проведения экспериментов по введению трансгенов в геном митохондрий. Одновременно показано, что культивирование штамма на минимальной среде с pH 5,5 и сукцинатом в качестве источника углерода и энергии приводит к полному подавлению экспрессии трасгена с геном RecA. Эти условия оптимальны для поддержания родительского и рекомбинантных штаммов с целью подавления активности механизма гомологичной рекомбинации. Этот подход способствует генетической и физиологической стабилизации штаммов при пассировании.

 Высокоэффективное накопление рекомбинантного продукта в митохондриях дрожжей Yarrowia lipolytica получено за счет использования новой системы адресации на основе лидерных нетранслируемых последовательностей мРНК.  Адресация рекомбинантного белка RecA в митохондрии обеспечивается за счет лидерных последовательностей мРНК гена SOD2 (5’-UTR и 3’-UTR), обладающих сродством к внешней поверхности митохондрий, и обеспечивающих котрансляционный транспорт RecA внутрь митохондрий. Штамм Y. lipolytica, несущий конструкцию pQ-SRUS, обладает уникальной для живых объектов способностью к интеграции ДНК-конструкций в митохондриальный геном, что было показано с применением тестерной конструкции pQ-NIHN, предназначенной для введения гена EYFP в область инициации трансляции митохондриального гена Y. lipolytica ND1. Разработанная иммунохимическая система оценки уровня накопления белка RecA в митохондриях Yarrowia lipolytica, а также репортерная система на основе цветного белка GFP в сочетании с ПЦР позволила однозначно доказать факт введения трансгена в митохондриальный геном Yarrowia lipolytica за счет гомологичной рекомбинации. Система селекции компенсаторных замен в искусственно поддерживаемом в дрожжах митохондриальном геноме человека основана на функциональной эквивалетности генов рРНК дрожжей Y. lipolytica и человека и том факте, что наиболее распространенные мутации, лежащие в основе митохондриальных синдромов MELAS и MERFF, нарушают функциональность генов митохондриальных Lys- Leu-специфичных рРНК.   Получен синтетический ген устойчивости к гигромицину, по кодоновому составу и организации старта трансляции адаптированного для экспрессии в митохондриях Y.  Lypolytica. Получена генетическая конструкция в форме линейной двунитевой ДНК для введения в состав митохондрального генома Y. lipolytica путем гомологичной рекомбинации с 3’-UTR оперона 1. Получены трансформанты. Проведена оценка эффективности введения линейной ДНК-конструкции в митохондриальный геном.  Сопоставляя достигнутый уровень ПНИ с лучшими отечественными и зарубежными аналогами, необходимо отметить, что разработка методов генной инженерии для работы с геномом митохондрий является полностью новым направлением биотехнологии, не имеющим аналогов. Этот подход позволяет добиться решения основной задачи проекта – разработать метод поддержания репликации интактного генома митохондрий человека в гетерологичной системе, позволяющей проводить направленную коррекцию дефектов с помощью гомологичной рекомбинации.

Практическая значимость исследования
Ожидается, что в срок 2 года с момента окончания Развитие ПНИ в рамках проекта будут проведены доклинические испытания нового средства генотерапии митохондриальных болезней чело-века. Использование новой системы для адресации рекомбинантых белков в митохондрии может быть использовано для создания продуцентов практических важных продуктов, неустойчивых в цитоплазме и секреторной системе дрожжей, непосредственно в ходе ПНИ или немедленно после их завершения.Ожидаемый социально-экономических эффект от использования нового способа генотерапии митохондриальных болезней человека, созданного на основе полученных результатов заключается в уникальной возможности повышения качества жизни пациентов, страдающих от тяжелых заболеваний, которые в настоящее время считаются неизлечимыми (поддаются только кратковременному и неполному симптоматическому воздействию).