Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0110

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0110
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Название доклада
Разработка методов получения модифицированных высокоаффинных ДНК-аптамеров и создание на их основе нового эффективного средства для противоопухолевой терапии
Докладчик
Чумаков Степан Петрович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Основной целью проекта является разработка нового функционального инструментария, с помощью которого будет возможно быстро и эффективно получать олигонуклеотидные соединения, избирательно связывающие наиболее востребованные биологические мишени – высокогликозилированные секретируемые белки и белки, расположенные на поверхности клеток.
К другой цели относится создание нового терапевтического средства – противоопухолевого ДНК-аптамера на основе модифицированных нуклеотидов, нацеленного на высокогликозилированный рецептор, присутствующий на поверхности опухолевых клеток. Терапевтическое средство должно обладать большей эффективностью, за счет большей аффинности и специфичности в отношении своей мишени, чем разрабатываемые аналоги - моноклональные антитела, а также большей биодоступностью и равной или превосходящей аналоги стабильностью в биологических жидкостях.
Актуальность и новизна исследования
Главным принципом в создании терапевтических препаратов является максимальная селективность при минимальном действии на прочие мишени. Это сочетание редко встречается у фармакологических препаратов – малых молекул, которые обычно взаимодействуют с целыми классами мишеней. Это обуславливает широкий спектр действия, но расплатой за это явлется наличие побочных эффектов от применения. Среди перспективных биомолекул особое место занимают аптамеры – биополимеры на основе ДНК, РНК или белковых цепей. ДНК и РНК аптамеры представляют собой олигомеры, прошедшие отбор in vitro на способность связываться с высокой аффинностью и специфичностью с «мишенью» на молекулярном уровне. Они значительно превосходят по своим характеристикам моноклональные и поликлональные антитела в клинике: имеют высокую аффинность и специфичность, легко и быстро синтезируются и т.д. Аптамеры неиммунногенны и способны проникать внутрь клеток, стабильны и устойчивы к денатурации и деградации, могут храниться в лиофилизованном виде. В отличие от моноклональных антител, селекция аптамеров целиком протекает in vitro, в контролируемых условиях. В зависимости от назначения, аптамеры могут быть модифицированы и химически защищены от деградации нуклеазами или иными агрессивными средами. Использование для разработки анти-CD47 терапии модифицированных ДНК-аптамеров, обладающих высоким сродством к гликозилированным белкам, позволит решить проблемы биодоступности, стабильности, селективности и стоимости производства, характерные для препаратов на основе моноклональных антител, что в результате приведет к получению высокоэффективного онкотерапевтического средства, имеющего хорошие перспективы клинического применения.
Описание исследования

Задача проекта связана с созданием ДНК-аптамера, способного высокоэффективно связываться с белком-мишенью CD47 и разработкой на его основе противоопухолевого препарата. Выскогликозилированная структура мишени CD47 определяет невысокие шансы отобрать ДНК-аптамер, обладающий необходимой степенью аффинности из олигонуклеотидных библиотек немодифицированных фрагментов ДНК. Для придания отбираемым ДНК-аптамерам большего тропизма к гликозилированным белкам, а именно, к олигосахаридным остаткам, в структуру ДНК-аптамеров будут введены модифицированные нуклеотиды, несущие производные борной кислоты на основе нафталимида или хинолина в качестве функциональных групп. Ранее показано, что модификацией, минимально затрагивающей распознавание нуклеозида полимеразой, является присоединение функциональной группы к С5-позиции пиримидиновых оснований. Для пуриновых оснований предпочтительно присоединение группировок по седьмой позиции с замещением азота на углерод (7-деазапурины).  В качестве основной стратегии использовано присоединение функциональных групп при помощи различных линкеров по С5-позиции к дезоксиуридину. Синтезирована серия из не менее чем 16 вариантов производных дезоксиуридин-трифосфата, в которых производные борной кислоты на основе нафталимида и хинолина будут присоединены алкильными линкерами различной длины. Соединения проверены на способность участвовать в реакции полимеризации ДНК в ходе ПЦР. Способность инкорпорировать модифицированные нуклеозидтрифосфаты будет проверена для термостабильных ДНК-полимераз, принадлежащих к разным семействам, всего будут протестированы семь полимераз: Taq, Tth, Pfu, Pwo, Tfl, Vent и Deep Vent. На основании проведенных экспериментов определена оптимальная структура и длина линкера, соединяющего функциональную группу с гетероциклическим основанием. Далее среди отобранных соединений проверена способность взаимодействовать с олигосахаридами путем оценки эффективности связывания флуоресцеин-меченого модифицированного поли-дезоксиуридина и иммобилизованных на твердой фазе олигосахаридов. Определено соединение, сохраняющее наибольшую аффинность. На основе этого синтезирована олигонуклеотидная библиотека с модифицированными нуклеотидами, которая была использована для отбора ДНК-аптамеров, обладающих максимальной аффинностью по отношению к внеклеточному гликозилированному фрагменту рецептора CD47 при помощи метода SELEX. Параллельно была создана эукариотическая линия-продуцент фрагмента CD47 - мишени для поиска аффинного ДНК-аптамера. Для оценки эффективности блокирующего ДНК-аптамера на взаимодействие между CD47 и SIRPa разработан иммунологический тест, с помощью которого была оценена способность рекомбинантного CD47 связываться с SIRPa, а также определены условия, приводящие к диссоциации блокаторов СD47 (моноклональных антител). После получения рекомбинантного фрагмента CD47, он был иммобилизован за гистидиновую метку на Ni-NTA-модифицированных агарозных микросферах и использован в качестве мишени для проведения отбора аффинных ДНК-аптамеров методом SELEX из аптамерных олигонуклеотидных библиотек, одна из которых содержит модифицированные нуклеотиды, а вторая – аналогичные не модифицированные (не менее 10 раундов). Было отобрано 10 аптамеров со способностью блокировать взаимодействие CD47 и SIRPa. Далее их действие было оценено ex vivo на культуре раковых клеток U937, характеризующихся высокими уровнями экспрессии CD47. После следующих тестов был отобран ДНК-аптамер, обладающий наибольшим сродством к CD47 и способностью блокировать его взаимодействие с SIRPa, была определена его константа диссоциации методом поверхностного плазмонного резонанса и проведена оценка его устойчивости к гидролизу в присутствии нуклеаз. Далее эффективность действия аптамера оценена in vivo на мышиной модели. Для этого мышам, с привитыми перевиваемыми опухолями, экспрессирующими люциферазу p. pyralis, будут однократно введены различные дозы терапевтического аптамера, после чего динамика развития опухоли оценена при помощи люминесцентного имаджинга. Далее эффективность действия терапевтического аптамера оценена как в составе комплексной терапии с наиболее распространенными химиотерапевтическими препаратами, так и в виде монотерапии. В экспериментах на мышах определен уровень токсичности и сравнение эффективности действия аптамера и основных на сегодняшний момент претендентов на роль анти-CD47-терапевтического средства – моноклональных блокирующих антител. 

Результаты исследования

Разработана и испытана новая технология получения модифицированных нуклеозидтрифосфатов с присоединенными к гетероциклическим основаниям функциональными группами, обладающих высокой аффинностью к полисахаридам, в том числе, составляющим гликозидную часть белка. Определена структура функциональной группы и длина линкера, соединяющего ее с нуклеозидом, обеспечивающие максимальное сродство модифицированного нуклеозида к полисахаридам с сохранением его способности являться субстратом для термостабильной ДНК-полимеразы. Эти два результата составляют основу нового мощного инструмента для получения высокоаффинных амплифицируемых лигандов, обладающих избирательным сродством к гликозилированным мишеням, в т.ч., секретируемым белкам – гормонам и цитокинам и поверхностным белкам-рецепторам. Эти группы белков наиболее часто выступают в роли мишеней при поиске новых лекарственных средств для терапии метаболических расстройств и онкопатологий. Создано новое эффективное средство для терапии широкого спектра злокачественных заболеваний – блокирующий ДНК-аптамер против поверхностного рецептора CD47. Полученный аптамер обладает высокой стабильностью в биологических жидкостях, превосходящей таковую у моноклональных антител, более высокой афинностью к CD47 и меньшей эффективной дозировкой при системном применении, а также более высокой биодоступностью вследствие примерно 50-кратной разницы в размерах молекул. Еще один результ выполнения проекта - получение систематических сведений о влиянии структуры функциональных групп, содержащих ароматические бороновые кислоты, и влияние длины линкеров на способность этих функциональных групп эффективно связывать полисахариды в составе гликозилированных белков, находясь в составе модифицированного ДНК-аптамера и при этом не интерферируя с ферментативной амплификацией самого аптамера. Эти сведения облегчат разработку иных модифицированных нулкеозидтрифосфатов, обладающих избирательным сродством к другим классам мишеней. Разработана новая технология получения модифицированных нуклеозидтрифосфатов, обладающих высокой аффинностью к полисахаридам, в т.ч., составляющим гликозидную часть белка. Определена структура функциональной группы и длина линкера, соединяющего ее с нуклеозидом, обеспечивающие максимальное сродство к полисахаридам с сохранением способности являться субстратом для термостабильной ДНК-полимеразы. Создан мощный инструмент для получения высокоаффинных лигандов гликозилированных мишеней - секретируемых белков и поверхностных белков-рецепторов – наиболее частых мишеней для терапии метаболических расстройств, онкопатологий, моно-и полигенных заболеваний. Создано новое средство для терапии онкопатологий – блокирующий ДНК-аптамер против рецептора CD47, обладающий высокой стабильностью в биологических жидкостях, высокой афинностью к CD47, меньшей эффективной дозировкой при системном применении, чем у моноклональных антител и более высокой биодоступностью вследствие меньшего размера молекулы. Еще один результат проекта - получение систематических сведений о влиянии структуры функциональных групп, содержащих ароматические бороновые кислоты, и длины линкеров на их способность эффективно связывать полисахариды в составе гликозилированных белков. Такие сведения облегчат дальнейшую разработку иных модифицированных нулкеозидтрифосфатов, обладающих избирательным сродством к другим классам мишеней.

Практическая значимость исследования
Предполагается, что блокирующий аптамер на CD47 будет обладать высокой эффективностью как в составе монотерапии, так и в составе комплексной химиотерапии в роли адъювантного средства. В этом случае ожидается возникновение синергического эффекта от применения химических агентов – цитостатиков, непосредственно угнетающих пролиферацию опухолевых клеток и анти-CD47-препаратов, позволяющих иммунной системе пациента эффективно атаковать опухолевые клетки. После проведения необходимых клинических испытаний терапевтический аптамер может применяться непосредственно в составе уже существующей комплексной химиотерапии. Одновременно с этим терапевтический ДНК-аптамер за счет своей более высокой биодоступности, меньшей иммуногенности и ожидаемого более высокого сродства к белку-мишени будет обладать рядом преимуществ по сравнению с функциональными аналогами – моноклональными антителами. Другим важным конкурентным преимуществом терапевтического аптамера является существенно более низкая стоимость производства и высокая стабильность соединения, что может дополнительно облегчить его внедрение в медицинскую практику и максимально широкое применение.
Практические сведения о влиянии функциональных групп и соединяющих их линкеров на свойства и эффективность модифицированных ДНК-аптамеров будут востребованы в ходе разработки новых модификаций нуклеозидтрифосфатов для создания аптамеров, обладающих повышенным сродством к специфическим группам мишеней.
Постер

14.604.21.0110.ppt