Регистрация / Вход
Прислать материал

14.616.21.0062

Аннотация скачать
Общие сведения
Номер
14.616.21.0062
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"
Название доклада
Рациональный поиск и дизайн низкомолекулярных функциональных миметиков нейротрофического фактора глиальных клеток GDNF для потенциального использования в инновационной, изменяющей течение заболевания терапии болезни Паркинсона
Докладчик
Зефиров Николай Серафимович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель Проекта состоит в получении значимых научных результатов, позволяющих переходить к созданию новых классов лекарственных препаратов для лечения болезни Паркинсона (БП), и в разработке технологий мирового уровня для изменяющей течение заболевания терапии болезни Паркинсона. Для выполнения поставленной цели задействованы международные интеграционные процессы в науке и сформированы устойчивые кооперационные связи МГУ имени М.В.Ломоносова и Университета Хельсинки (Финляндия), закладываются основы технологии мирового уровня, направленной на инновационное лечение сложных нейродегенеративных расстройств.
В Проекте решаются задачи направленного создания низкомолекулярных соединений, обладающих защитным и восстанавливающим действием на дофаминергические (ДА) нейроны. Выполнение поставленных задач базируется на современных биоинформационных технологиях, основанных на высокопроизводительном профильном скрининге уникальных органических соединений, позволяющем установить молекулярные объекты, активирующие тирозинкиназу RET, и на структурных исследованиях взаимодействий корецептора GFRα1 с низкомолекулярными органическими соединениями при помощи высокотехнологичных методов ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и молекулярного моделирования, впервые позволивших определить домены связывания искусственных лигандов GFRα1 и проводить их структурные модификации для увеличения целевой биологической активности.
Актуальность и новизна исследования
Болезнь Паркинсона (БП) диагностируется у более чем 5-ти миллионов людей во всём мире, а среди населения в возрасте старше 60 лет этот диагноз встречается у 1% жителей. В настоящее время отсутствуют терапевтические средства и методы излечения и профилактики этого нейродегенеративного заболевания, вызываемого прогрессирующей потерей дофаминергических (ДА) нейронов, а используемые методы лечения, в том числе Леводопой, носят сугубо симптоматический, паллиативный характер. Согласно «Прогнозу научно-технологического развития Российской Федерации на период до 2030 года» старение населения, изменение образа жизни человека и общества, рост социально-значимых заболеваний, к которым относится БП, являются глобальным вызовом.
В выполняемом Проекте разрабатываются низкомолекулярные функциональные миметики нейротрофического фактора глиальных клеток GDNF, представляющего собой макромолекулярное соединение белковой природы, обладающее доказанным восстанавливающим действием на повреждённые ДА нейроны и оказывающее терапевтический эффект как на животных моделях БП, так и в клинических испытаниях на людях, однако эта эффективность ограничивается необходимостью интрацеребрального введения. Таким образом, низкомолекулярные соединения, проникающие через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и обладающие подобной GDNF биологической активностью, могут представлять собой инновационные терапевтические агенты для БП, способны внести весомый вклад в решение проблемы профилактики и терапии БП и имеют большой потенциал для реализации в России и высокую степень конкурентоспособности за рубежом.
Описание исследования

GDNF является родоначальным членом семейства GDNF лигандов – GFLs, к которому относятся также нейротурин (NRTN), артемин (ARTN) и персефин (PSPN). Все эти нейротрофные факторы представляют собой секреторные белки, регулирующие развитие и поддержку нейронов нервной системы. GFLs осуществляют передачу сигнала через рецепторный комплекс, состоящий из тирозинкиназы RET и лиганд-связывающих корецепторов GFRα, причём у каждого GFL-лиганда есть свой собственный специфический корецептор, например, у GDNF этим корецептором является GFRα1. Образование тройного рецепторного комплекса GFL/GFRα/RET приводит к фосфорилированию специфических тирозиновых остатков в киназном домене RET и последующей активации нисходящих сигнальных путей, включающих RAS/ERK, PI3K/AKT, Src-семейство киназ, PLC-гамма и JNK каскады, контролирующих пролиферацию, дифференциацию и жизнеспособность нейронов. Одним из основных недостатков применения GFLs, в частности GDNF, в качестве терапевтических средств для БП, является их высокое сродство к внеклеточному матриксу, что не позволяет нейротрофическим факторам распространяться на большое расстояние от места инъекции и достигать большинства повреждённых ДА нейронов, и наряду с внутричерепным оперативным вмешательством ограничивает применение данного вида терапии БП.

Для скрининга потенциальных функциональных миметиков GDNF использован разработанный в лаборатории профессора М.Саарма, Иностранного партнёра Проекта, люциферазный тест (Mol. Cell. Neurosci. 2010, 223–232). Метод характеризуется двумя клеточными линиями, экспрессирующими PathDetect ELK1 транс-репортирующую систему (Stratagene) для мониторинга активационного пути MAPK. Первая клеточная линия (StratαLUC) экспрессирует оба компонента GDNF рецепторного комплекса, человеческий GFRα1 и длинную изоформу RET. Вторая клеточная линия (NOstratα) экспрессирует только RET. Обе клеточные линии реагируют на GDNF (NOstratα только в присутствии растворённого GFRα1). Транс-репортирующая система PathDetect ELK1 основана на двух плазмидах: первая конститутивно экспрессирует гибридный белок, состоящий из активационного домена ELK1 транскрипционного активатора и ДНК-связывающего домена (DBD) другого транскрипционного активатора, GAL4. Вторая плазмида содержит GAL4 связывающие домены, контролирующие экспрессию люциферазного гена Photinus pyralis. Фосфорилирование активационного домена ELK1 компонентом MAPK активационного пути, ERK, вызывает взаимодействие между GAL4 DBD и его связывающими доменами в репортерной плазмиде, приводя к экспрессии люциферазы. Люцифераза катализирует реакцию, сопровождающуюся люминесценцией, интенсивность которой коррелирует со степенью активации MAPK сигнального пути. Для соединений, проявивших активность в люциферазном тесте, дальнейший механизм биологической активности изучался при помощи прямых методов по определению фосфорилирования RET (вестерн-блот).

Для теоретического исследования механизма действия потенциальных миметиков GDNF построена компьютерная модель комплекса GFRα1/GDNF на основе координат его кристаллографической структуры и рассчитана фармакофорная модель контактного участка взаимодействия GDNF и GFRα1. В программном пакете GROMACS 4.6 с использованием силового поля AMBER ff99SB и модели TIP3P для молекул воды в явном виде проведён расчёт траектории молекулярной динамики белка GFRα1 длиной 30 нс. Для ключевых аминокислотных остатков GFRα1 в фармакофорной модели зафиксирована низкая конформационная подвижность, что позволяет применить модель «жёсткого рецептора» при моделировании белок-лигандных взаимодействий для корецептора GFRα1 в сайте связывания GDNF.

Экспериментальное исследование взаимодействия потенциальных низкомолекулярных миметиков GDNF с корецептором GFRα1 проведено методом ЯМР спектроскопии в растворе с использованием методики Saturation Transfer Difference (STD, J. Am. Chem. Soc. 2001, 6108–6117) для определения участков лиганда, связывающихся с макромолекулярной мишенью. В процессе проведения STD эксперимента осуществлялось селективное насыщение протонов GFRα1, которое передавалось на протоны исследуемых соединений в случае их взаимодействия с белковой мишенью. Анализ разностного спектра приводил к установлению протонов тех участков низкомолекулярного соединения, которые взаимодействовали с корецептором GFRα1.

Результаты исследования

Изменяющая течение заболевания нейропротекторная терапия БП, недоступная в настоящее время, может базироваться на предупреждении развития нейродегенеративных изменений в клетке, обеспечении функционального восстановления частично повреждённых, но жизнеспособных клеток, увеличении числа нейронов (например, путём имплантации новых клеток или стимулирования деления существующих клеток). В настоящем Проекте для поиска новых агонистов тирозинкиназы RET разрабатывается новая мишень, представляющая собой область белка GFRα1 на участке поверхности связывания с GDNF – регион белок-белкового взаимодействия, стабилизация или имитирование которого может приводить к активации RET.

Для выполнения целей Проекта была сформирована библиотека низкомолекулярных органических соединений из коллекции кафедры медицинской химии и тонкого органического синтеза химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова и проведено моделирование взаимодействия компонентов этой библиотеки с белками GDNF и GFRα1. В исследуемую библиотеку были включены преимущественно новые органические соединения, содержащие гидрофобные и карбоксилатные фармакофорные фрагменты, единственный известный в литературе небелковый лиганд корецептора GFRα1 XIB4035, способный активировать комплекс GFRα1-RET (Neurochem. Int. 2003, 81‒86), и запатентованные миметики GFL (US Pat. Application 2013/0030180). Необходимо отметить, что двумя указанными источниками фактически представлена вся имеющаяся информация о низкомолекулярных органических соединениях, которые могут отвечать целям Проекта. Моделирование проводилось с 4-мя различными системами: участком белка GFRα1, соответствующий интерфейсу взаимодействия с GDNF; полной поверхностью доменов D2 и D3 белка GFRα1; полной поверхностью комплекса GFRα1/GDNF и областью поверхности комплекса GFRα1/GDNF на границе контакта обоих белков. Проведённые расчёты предсказали шесть возможных сайтов связывания изучаемых низкомолекулярных соединений с указанными биомакромолекулярными системами.

В ходе выполнения Проекта при помощи люциферазного теста исследованы более 350 уникальных низкомолекулярных органических соединений из коллекции кафедры медицинской химии и тонкого органического синтеза химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Среди изученных соединений идентифицированы активные в люциферазном тесте низкомолекулярные агенты, в микромолярных концентрациях активирующие MAPK сигнальный путь. Для двух соединений-хитов при помощи вестерн-блот установлено фосфорилирование RET. Молекулярное моделирование предсказывает расположение указанных низкомолекулярных соединений хитов в области белок-белкового контакта GFRα1/GDNF. Впоследствии были проведены структурные модификации молекулярного каркаса наиболее активных соединений и синтезирована сфокусированная библиотека из 35 новых низкомолекулярных органических соединений, обладающих улучшенным профилем физико-химических параметров по сравнению с родоначальными хитами. Для проявивших активность в люциферазном тесте соединений-хитов из сфокусированной библиотеки методами ЯМР в растворе установлено взаимодействие с корецептором GFRα1 (KD 1-10 µM). Продемонстрировано дозозависимое усиление активирующего действия GDNF на фосфорилирование RET в присутствии разработанных низкомолекулярных агентов, что указывает на стабилизацию белок-белкового взаимодействия GFRα1/GDNF.

Практическая значимость исследования
GDNF оказывает комплексный защитный эффект на клетки дофаминергической системы через клеточные каскады сигнальных реакций, которые задействованы в регуляции процессов апоптоза, метаболизма и окислительно-восстановительного гомеостаза. GDNF стимулирует высвобождение дофамина, что благотворно влияет на такие дофамин-зависимые поведенческие реакции, как реакция на стресс, двигательные и когнитивные способности. Имеются данные клинических исследований, отмечающие улучшение состояния пациентов с БП при интрацеребральном введении GDNF. Разработанные в ходе выполнения Проекта низкомолекулярные агенты усиливают активирующее влияние GDNF на фосфорилирование RET, что представляет собой новый способ достижения целевой биологической активности, в результате проявления которой может достигаться устойчивый нейропротекторный эффект.