Регистрация / Вход
Прислать материал

14.613.21.0058

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.613.21.0058
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский радиологический центр" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Название доклада
Создание in vitro модели метастазирования солидных опухолей человека и разработка флуоресцентного устройства для оценки эпителио-мезенхимальной трансформации.
Докладчик
Сахаров Дмитрий Андреевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целью исследования является изучение процесса эпителио-мезенхимальной трансформации в ходе метастазирования солидных опухолей человека в динамических условиях in vitro с использованием онлайн флуоресцентного мониторирования.
Для наблюдения за поведением опухолевых клеток в чипе и регистрации образования метастазов в режиме реального времени планируется разработать систему оптического мониторинга флуоресцентного сигнала в клеточном чипе с использованием оптоволоконных световодов. Проект предусматривает создание клеточных линий рака человека, имеющих флуоресцентные белки-репортеры, отражающие эпителиальное или мезенхимальное состояние клеток. Разработанная методика и устройство могут быть использованы для высокопроизводительного поиска потенциальных противоопухолевых лекарственных средств, мишенями которых будут являться определенные стадии каскада метастазирования.
Актуальность и новизна исследования
Популярным подходом для изучения метастазирования является использование ксенографтных моделей на основе иммунодефицитных мышей. Подавление иммунитета у мышей не приводит к отторжению опухолевых клеток человека и позволяет формироваться ервичной опухоли и метастазам в целевых органах, включая легкие и костный мозг. Недостатком такого подхода является невозможность учесть вклад нормальной иммунной системы в развитие онкологического заболевания и неадекватность оценки исследуемого терапевтического воздействия. Кроме того, фундаментальное различие мыши и человека на молекулярном и системном уровне зачастую не позволяет судить о процессах и механизмах развития рака у человека по результатам, полученным на модельных ксенографтных системах. Экспериментальные системы изучения метастазирования in vitro обладают существенным преимуществом, поскольку они открыты для манипуляций и условия проведения эксперимента на всех этапах находятся под плотным контролем исследователя. На сегодняшний день существует широкий спектр подходов in vitro, моделирующих отдельные единичные этапы каскада метастазирования. Они включают, главным образом, простые статические тесты на миграцию и инвазию клеток, а также ограниченное число более сложных подходов, основанных на использовании микрофлюидных систем и направленных на воспроизведение нескольких взаимосвязанных этапов процесса образования метастазов. Предлагаемый проект направлен на разработку in vitro модели метастазирования солидных
опухолей, на основании которой впервые станет возможным воспроизведение полного каскада метастазирования.
Описание исследования

Для разработки методики оценки соотношения эпителиальных и мезенхимальных клеток в динамических условиях мы предлагаем использовать клеточные линии рака человека, экспрессирующие флуоресцентные молекулы-репортеры. При этом клетки будут постоянно экспрессировать репортер одного цвета (в зеленом спектре эмиссии), а при переключении экспрессии генов на мезенхимальный профиль будет появляться репортер другого цвета (красный спектр эмиссии). Соотношение эпителиальных и мезенхимальных клеток мы предлагаем определять по соотношению суммарных интенсивностей эмиссии флуорофоров в соответствующих спектрах. Для оценки этого соотношения в контуре микрофлюидного чипа в процессе микроцикуляции опухолевых клеток мы предлагаем регистрировать в режиме реального времени флуоресценцию среды с клетками с использованием оптоволоконных световодов.

В качестве основы для данного проекта мы планируем использовать микрофлюидную платформу, разработанную ранее в рамках ГК №16.522.12.2015 Министерства образования и науки РФ. Отдел трансляционной онкологии оснащен 7 такими платформами. Мы предлагаем модифицировать ее таким образом, чтобы в ней одновременно возможно было культивировать модели первичной опухоли и целевых органов метастазирования, объединенных одним контуром с постоянно циркулирующей клеточной средой. Кроме того, конструкция чипа будет предусматривать возможность регистрации флуоресцентного сигнала в контуре с использованием оптоволоконных световодов, а также возможность вводить в контур тестируемое лекарственное средство.

Мы планируем использовать клеточные линии нескольких видов рака человека, включая рак молочной железы, колоректальный, панкреатический рак и рак легких. Все они будут в постоянном режиме экспрессировать белок-репортер с эмиссией в зеленом спектре (GFP), и одновременно иметь репортер с эмиссией в красном спектре (dsRed-подобный), который будет находиться под контролем мезенхимального промотора.

Мы предлагаем разработать макет устройства, которое позволит посредством оптоволокон в режиме реального времени регистрировать флуоресценцию в контуре микрофлюидного чипа в зеленом и красном спектре одновременно, а также количественно оценивать уровень этих сигналов. Макет предположительно будет построен на комбинации двух лазерных диодов с светофильтрами под красный и зеленый флуорофоры, двух фотоумножителей с фильтрами и электронной схемы для проведения экспериментов, регистрации сигналов и обработки данных в режиме реального времени.

Оценка влияния лекарственного препарата на клетки в микрофлюидном чипе будет осуществляться по следующему принципу. Мы планируем регистрировать флуоресцентный сигнал одновременно в зеленом и красном спектре эмиссии. Таким образом мы определим степень трансформации циркулирующих в контуре клеток в мезенхимальное состояние и, следовательно, влияние тестируемого вещества на эпителиально-мезенхимальную пластичность. Помимо того, мы будем регистрировать флуоресцентный сигнал в модели целевого органа метастазирования и выявим эффект лекарственного препарата непосредственно на образование метастаза.

В ходе предлагаемого проекта мы планируем разработать комплекс методик для проведения экспериментов по воспроизведению каскада метастазирования in vitro в микрофлюидном чипе. Методики будут включать подготовку реактивов, чипов и клеток, собственно проведение эксперимента с регистрацией уровня флуоресцентного сигнала в контуре в режиме реального времени, а также схему анализа и интерпретации полученных данных.

Результаты исследования

Комплекс методик, который мы планируем разработать в ходе предлагаемого проекта, будет включать весь спектр работ по подготовке, проведению и обработке и интерпретации результатов экспериментов по воспроизведению каскада метастазирования in vitro в микрофлюидном чипе. Методики охватят создание клеточных линий различных раков человека, несущих генетические конструкции флуоресцентных репортеров эпителиально-мезенхимальной трансформации, моделирование первичной опухоли и циркулирующих раковых клеток. Наконец, методики будут содержать протоколы по работе с флуоресцентным устройством, предназначенным для регистрации интенсивности флуоресцентного сигнала в режиме реального времени по двум участкам спектра, а также рекомендации по методам обработки и интерпретации полученных результатов. 

Полученные в ходе выполнения предлагаемого проекта клеточные линии различных видов рака человека, экспрессирующие флуоресцентные репортеры, позволят в режиме реального времени регистрировать трансформацию из эпителиального в мезенхимальное состояние. Такие клетки будут являться основой для изучения влияния микроокружения в микрофлюидном чипе на эпителиально-мезенхимальную пластичность клеток, оценивать в целом их поведение в чипе на разных стадиях каскада метастазирования, а также оценивать эффективность тестируемого лекарственного препарата. Методика оценки степени воздействия/ингибирования лекарственных средств на каскад метастазирования и, в частности, на эпителио-мезенхимальную пластичность раковых клеток является основой для реализации высокопроизводительного поиска противометастатических препаратов. Широта динамического диапазона флуоресцентного сигнала и чувствительности его детекции позволит включить в методику эксперименты с различными концентрациями тестируемых веществ с целью определения их концентрации полуингибирования.

Отобранная и модифицированная в рамках предлагаемого проекта микрофлюидная платформа позволит моделировать полный цикл каскада метастазирования. А именно, в составе одного чипа будет возможно расположить модель первичной опухоли или биопсийный материал пациента, а также микромодель целевого органа метастазирования (печень, костный мозг). Они будут объединены одним замкнутым микрофлюидным контуром – имитацией кровотока, по которому смогут перемещаться циркулирующие опухолевые клетки. Кроме того, совместимость платформы с флуоресцентным модулем позволит в режиме реального времени получать количественные оценки эпителиально-мезенхимальной пластичности клеток в контуре, а также клеток, проходящих последующие этапы каскада метастазирования (экстравазация, миграция в целевой орган). Такое устройство будет востребовано как для фундаментальных исследований в области изучения развития рака, так и для выявления новых биомаркеров метастазирования и поиска терапевтических мишеней.

Практическая значимость исследования
В результате модификации клеток будет получен востребованный в научных кругах продукт, который в дальнейшем, после защиты интеллектуальной собственности, может быть востребован как в лабораториях, занимающихся фундаментальными исследованиями, так и в компаниях, разрабатывающих новые лекарственные средства. Разрабатываемые методики будут являться основой метода высокопроизводительного поиска эффективных лекарственных средств, а также изучения факторов, влияющих на эффективность метастазирования и будут востребованы как международными участниками консорциума, так и всей научной общественностью в целом, поскольку представляет собой мощный инструмент фундаментальных и прикладных исследований в области развития злокачественных заболеваний.
Область применения флуоресцентного устройства со световодами не ограничивается изучением метастазирования в рамках данного
проекта. При незначительной модификации лазерных диодов (изменение длин волн) и чувствительности фотоумножителей, возможно будет создать следующие поколения приборов, применимые в рутинной работе молекулярно-биологических лабораторий. Производственные мощности и репутация Индустриального партнера, а также привлечение Иностранных партнеров, позволяет рассчитывать на скорейший переход от макетов к опытным сериям прибора.
Постер

Poster_Hertzen_EMT.ppt