Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0075

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0075
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Сибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Название доклада
Разработка набора реагентов для определения риска развития частых осложнений при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).
Докладчик
Сазонов Алексей Эдуардович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Реализуемый проект направлен на разработку способа оценки рисков жизнеугрожающих осложнений, в особенности развития осложнений и роста частоты обострений, при хронической обструктивной болезни легких. Целью проекта является разработка экспериментального образца набора реагентов для оценки рисков частых осложнений при ХОБЛ на основе генетической информации о пациенте и состава микробиоты его легких и кала.
Актуальность и новизна исследования
Смертность от хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) на настоящий момент занимает седьмое место среди всех причин смерти, однако, к 2030 году по прогнозам Всемирной организации здравоохранения ХОБЛ будет занимать третье место в структуре смертности, догнав сердечно-сосудистую патологию. При ХОБЛ решающее значение для оценки состояния больного, подбора лечения и прогноза имеет точная оценка характера течения заболевания. Основной причиной смерти и резкого ухудшения самочувствия при ХОБЛ является не персистенция заболевания сама по себе, а осложнения, возникающие при ХОБЛ. Одним из наиболее важных факторов, влияющих на появление осложнений, является частота бактериальных обострений ХОБЛ. С каждым эпизодом обострения состояние больного необратимо ухудшается, и он переходит в более высокую группу по степеням тяжести. В виду этого, решающая роль в борьбе с данным заболеванием и его проявлениями отводится профилактическим мерам, а именно определению риска развития ХОБЛ с частыми обострениями для его последующей корректировки. Исследование всей совокупности микроорганизмов, населяющих дыхательные пути (микробиоты), с применением современных методов статистического анализа, адаптированных для метагеномных исследований, позволит определить микроорганизмы, статистически достоверно ассоциированные с развитием фенотипа с частыми обострениями и осложнениями болезни, что позволит создать набор реагентов, позволяющий определять риск развития осложнений при ХОБЛ.
Описание исследования

В рамках работ по проекту на начальном этапе осуществлялась подготовка к забору биоматериала и проведению клинического исследования. Для этого проводилась разработка методик подготовки и хранения биологического материала: кала, орофарингеального мазка и мокроты пациентов с ХОБЛ. Методики пробоподготовки биоматериала включали в себя перечень требований к забору биоматериала, его транспортировке, приемке и учету. Для выбора температурного режима, подходящего для хранения биоматериала, проводилась оценка влияния 8 различных режимов на  метагеномный состав образцов и побор оптимального метода. Для биоматериала всех видов были разработаны методики оценки качества образцов. С целью выполнения требований по обеспечению безопасности для жизни и здоровья людей разработан и утвержден локальным этическим комитетом протокол клинического исследования. В рамках протокола разработаны критерии включения и исключения пациентов из исследования, основанные на рекомендации согласительных международных документов. Как часть протокола клинических исследований разработана индивидуальная регистрационная карта и медицинская анкета-вопросник. Данная анкета включает в себя шкалу Medical Research Council Dyspnea Scale и вопросник «Госпиталя Святого Георгия». В исследование были включены 500 человек, у которых проводился забор биоматериалов нескольких типов: орофарингеальный мазок, мокрота, кал и буккальный соскоб для генетического профилирования. Весь поступающий материал прошел оценку качества. Для стандартизации процесса выделения ДНК из метагеномных образцов были разработаны методики выделения ДНК. Метагеномный анализ в формате оценки разнообразия последовательностей гена 16S рРНК (для образцов орофарингеального мазка и мокроты) в суммарном образце ДНК осуществляли согласно протоколу, рекомендованному производителем Illumina для секвенатора MiSeq. Для биоинформатического анализа прочтений 16S-секвенирования было использовано свободное программное обеспечение QIIME версии 1.9.1. Для таксономической классификации прочтений в рамках референсного подхода использовалась база данных GreenGenes версии 13.5. Выбор типа биоматериала для разработки набора осуществлялся путем сравнения индексов α- и β-разнообразия, рассчитанных для микробиоты мокроты и орофарингеального мазка и проведением прокрустова анализа и теста Мантела. Для поиска статистических различий в составе микробиоты больных ХОБЛ использовалась модель FitZig пакета metagenomeSeq языка R. Подготовка фрагментной библиотеки ДНК и полногеномное секвенирование (для образцов кала)  на платформе SOLiD 5500 (Life Technologies, Foster City, CA, USA) были произведены в соответствие с инструкциями от производителя, выходная длина прочтений составила 50 п.н. Полученные в результате секвенирования прочтения в цветовом формате прошли стандартную фильтрацию по качеству. Все прочтения, длина которых после фильтраций стала меньше 30 нуклеотидов или которые картировались на геном человека, были удалены. Далее прочтения поступали в дальнейший анализ таксономического и функционального разнообразия образцов. Бактериальный состав метагеномных образцов определяли в результате картирования на неизбыточный референсный каталог из репрезентативных геномов микроорганизмов с использованием программного пакета bowtie. Для поиска маркерных генов микробиоты использован составленный список генов. Для обнаружения последовательностей гомологичных известным генам-детерминантам микробной устойчивости в образцах использовался Resistance Gene Identifier Tool. Статистические различия в представленности генов антибиотикорезистентности определяли с использованием теста Манна-Уитни при поправке по Бенджамини. Для определения полиморфных маркеров генома человека, связанных с ХОБЛ, была составлена база данных полиморфизмов. На основе базы был проведен отбор полиморфных маркеров, связанных с осложнениями ХОБЛ. Для генотипирования образцов буккального соскоба проводили реакцию удлинения зонда с последующим масс-спектрометрическим анализом продуктов. Разработка алгоритма системной оценки рисков проводилась с использованием уравнений логистической регрессии. Чувствительность и специфичность модели определяли путем анализа ROC-кривых. На основе переменных – маркерных генов микробиоты и полиморфизмов человека, включенных в логистические уравнения, разработан экспериментальный набор реагентов для оценки риска развития осложнений ХОБЛ и программное обеспечение к нему. Оценка чувствительности и специфичности набора будет проведена согласно разработанным методикам. 

Результаты исследования

В результате реализации проекта были разработаны методики подготовки, хранения и оценки качества биологического материала различных типов. Разработана методика выделения метагеномной ДНК из образцов биоматериала. Подготовлен протокол клинического исследования. По данному протоколу проведено обследование 500 человек, больных ХОБЛ, и набран биологический материл. Коллекция биоматериала составила 500 образцов орофарингельных мазков, 150 образцов мокроты, 150 образцов кали и 150 образцов буккального соскоба. Весь материал, вошедший в коллекцию, прошел оценку качества и был признан пригодным для дальнейших исследований. В результате биоинформатического анализа образцов орофарингеального мазка и мокроты были получены метагеномные профили. Осуществлен выбор биоматериала (орофарингеальный мазок) для последующего использования в наборе реагентов в качестве источника биомаркеров. В результате статистического анализа установлено, что в микробиоте орофарингеального мазка на уровне рода у больных с осложненным течением ХОБЛ выражена представленность Porphyromonas, Aggregatibacter, Filifactor, Capnocytophaga, Slackia, Bacillus, Pyramidobacter, Bacteroides и Treponema и снижена представленность Butyrivibrio и Peptoniphilus. На видовом уровне больные с наличием осложнений ХОБЛ характеризовались повышением представленности бактерии Prevotella nanceiensis, Aggregatibacter segnis, Atopobium rimae, Rothia aeria, Pyramidobacter piscolens, Capnocytophaga ochracea, Treponema amylovorum и Treponema socranskii и снижением Pseudomonas viridiflava. При оценке состава микробиоты у пациентов зависимости от частоты обострений ХОБЛ было установлено повышение представленности бактерий видов Bulleidia moorei, Porphyromonas endodontalis, Streptobacillus moniliformis, Treponema amylovorum и родов Alloiococcus, Bulleidia, Streptobacillus, Treponema у пациентов без частых обострений ХОБЛ. У лиц с частыми обострений ХОБЛ обнаружено повышение представленности видов Brevundimonas diminuta, Lactobacillus zeae, Micrococcus luteus, Pseudomonas viridiflava, Pyramidobacter piscolens и родов Brevundimonas, Pyramidobacter, Sphingobium, Stenotrophomonas. В результате исследования представленности генов антибиотикорезистентности в кишечной микробиоте, установлено, что больные ХОБЛ по сравнению со здоровым контролем характеризуются увеличением представленности 29 различных генов антибиотикорезистентности, опосредующим устойчивость к таким группам препаратов, как цефалоспорины, макролиды, аминогликозиды, пенициллины и др. На основе клинической информации, а также данных о составе микробиоты, представленности генов антибиотикорезистентности и носительстве полиморфных маркеров генома человека составлен системной оценки рисков ХОБЛ, выдающий рекомендации по ведению и лечению больных в зависимости от течения ХОБЛ и наличия резистентности. Алгоритм реализован в виде программного обеспечения. Уравнение логистической регрессии для предсказания риска осложнений ХОБЛ имело чувствительность 88,9%, специфичность 94,3%, при AUC 0,944. Уравнение логистической регрессии для предсказания риска обострений ХОБЛ имело чувствительность 82,6%, специфичность 80,7%, при AUC 0,867. На основе переменных – маркерных генов микробиоты и полиморфизмов человека, включенных в логистические уравнения, разработан экспериментальный набор реагентов, основанный на применении ПЦР.

Практическая значимость исследования
Разрабатываемый набор реагентов предназначен для определения наличия биомаркеров повышенного риска осложнений легочных заболеваний, в частности ХОБЛ. Область применения: научно-клинические учреждения здравоохранения, специализированные лечебно-профилактические учреждения, учреждения высшего профессионального образования и науки. Оценка комплексного статуса пациента, включающего в себя поиск полиморфизмов, ассоциированных с развитием ХОБЛ и его осложнений, оценка иммунного статуса по бактериальным маркерам кишечной микробиоты и поиск микробиотных маркеров в слизистой дыхательных путей даст дополнительную, клинически-значимую информацию для лечащего врача. Разработка и внедрение современных диагностических тест-систем для оценки генетических и микробиотических маркеров при ХОБЛ позволит создать новые подходы к персонифицированной терапии данного заболевания, что будет способствовать улучшению качества жизни пациентов, снизит затраты на их лечение, прямые (медикаментозное обеспечение, дорогостоящая экстренная медицинская помощь) и косвенные (длительные периоды нетрудоспособности, выплаты по инвалидности) затраты ресурсов здравоохранения.