Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0154

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0154
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"
Название доклада
Получение и исследование набора человеческих антител к гликопротеину вируса бешенства для создания средства экстренной профилактики заболевания на основе комбинации нейтрализующих антител
Докладчик
Алиев Теймур Кантамирович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель исследования - создание эффективного иммунотерапевтического средства для нейтрализации вируса бешенства
и предотвращения развития заболевания у людей.

Задачи.
1. Получение клонов гетерогибридом на основе В-лимфоцитов периферической крови человека,
продуцирующих полностью человеческие антитела к ГП вируса бешенства.
2. Выделение генов человеческих антител из клонов В-лимфоцитов, конструирование системы
экспрессии полноразмерных антител в клетках СНО.
3. Получение клеточных линий СНО, продуцентов рекомбинантных антител к гликопротеину
вируса бешенства, наработка экспериментальных образцов.
4. Исследование биологической активности рекомбинантных антител при моно- и
комбинированном применении.
Актуальность и новизна исследования
Бешенство, являясь летальной острой зоонозной природно-очаговой инфекцией, представляет
огромную опасность и, по оценке ВОЗ, по наносимому экономическому ущербу среди инфекционных болезней занимает 5 место. Согласно рекомендациям ВОЗ, экстренная профилактика бешенства базируется на своевременном введении антирабического иммуноглобулина и назначении курса иммунизации.В настоящее время используются два типа препаратов: лошадиная сыворотка ERIG, содержащая антитела против вируса бешенства и человеческий антирабический
иммуноглобулин HRIG.Ограничение применения сывороток животного происхождения обусловлены как серьезными
побочными эффектами вплоть до анафилактического шока, так и быстрым клиренсом препарата.
Человеческий иммуноглобулин от вакцинированных добровольцев не может удовлетворить всех
потребностей в нем.
Альтернативным подходом для решения вышеперечисленных проблем является создание
технологии получения рекомбинантных моноклональных антител, способных нейтрализовать
вирус бешенства. Рекомбинантные антитела, получаемые в клеточных линиях СНО, имеют ряд
преимуществ по сравнению с донорским антирабическим иммуноглобулином:
- отсутствует риск контаминации вирусами гепатита и ВИЧ;
- существует возможность масштабирования технологии и производства килограммовых
количеств препарата;
- рекомбинантные антитела имеют пониженную иммуногенность.
Учитывая значительную антигенную специфичность различных вариантов вируса бешенства и
мутационную изменчивость, ВОЗ рекомендует замещение человеческого иммуноглобулина не
отдельными моноклональными антителами, а комбинацией моноклональных антител к различным
эпитопам вирусного гликопротеина.
Описание исследования

Будет использована методология in vitro иммунизации. Будут использованы методические
разработки коллектива в области создания гибридных человеческих гибридом. Новизна подхода
состоит в том, что для получения гибридомы будут использованы не чисто миеломные клетки, а
гибриды мышиной миеломы линии NS1 и стимулированных В-лимфоцитов. Для проведения
иммунизации должно быть получено не менее 200 тысяч моноцитов периферической крови, не
менее 2 млн В-лимфоцитов и не менее 2 млн CD4+ лимфоцитов. В процессе отбора клоны В-
лимфоцитов будут тестироваться на кросс-реактивность с различными вариантами гликопротеина
(рекомбинантный очищенный белок, вакцина на основе инактивированного штамма). Метод in
vitro иммунизации позволяет получать полностью человеческие антитела, не прибегая к
дорогостоящему лицензионному использованию зарубежных технологий трансгенных мышей или
скринингу высокорепрезентативных фаговых библиотек.

Для выполнения данной задачи будет проведено выделение и определение нуклеотидной
последовательности генов вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей не менее 3-х
кандидатных человеческих антител из гетерогибридом.Конструирование системы экспрессии будет проводиться на основе полученного ранее коллективом проекта бипромоторного вектора, обеспечивающего равномерность уровня
экспрессии тяжелой и легкой цепей антител в клеточных линиях СНО.Для получения экспериментальных образцов рекомбинантных антител к ГП вируса бешенства в количестве, необходимом для проведения биологических испытаний, планируется получение
стабильных клеточных линий-продуцентов.

Будет проведен иммунохимический анализ рекомбинантных антител к ГП вируса бешенства,
исследованы их аффинность и эпитопная специфичность. Для определения специфической
активности экспериментальных образцов терапевтических антител против вируса бешенства
будет использован международный стандарт ВОЗ антирабического иммуноглобулина c
нейтрализующей активностью 30 МЕ/мл. Исследование биологической активности будет проводиться на модельных животных, летально
инфицированными подтипами вируса, наиболее распространенными на территории РФ. Будет
исследована нейтрализующая активность каждого из полученных антител в отдельности, а также
в их комбинации. Будет проведено исследование совместного применения антител и вакцины КОКАВ,
производимой в России, что будет максимально соответствовать режиму экстренной
профилактики бешенства, практикуемому в нашей стране.

Результаты исследования

В результате инкубации моноцитов из периферической крови человека с гликопротеином вируса бешенства (ГПВБ) в присутствии цитокинов были получены антиген-презентирующие дендритные клетки. Получены гетерогибридомы В-лимфоцитов человека и клеток мышиной миеломы путем соматической гибридизации с применением полиэтиленгликоля. Методом иммуноферментного анализа произведен отбор гибридомных клонов, продуцирующих человеческие антитела против ГПВБ. Произведена наработка клеток гетерогибридом для выделения генов иммуноглобулинов и проведения иммунохимической характеризации продуцируемых антител.

В результате проведенной селекции был отобран перспективный клон гетерогибридом 6B2 для проведения дальнейшей работы - выделения генов иммуноглобулинов и получения рекомбинантного аналога в клеточных линиях СНО.

Практическая значимость исследования
Одной из проблем в профилактике бешенства является недостаточный объем производства в
Российской Федерации антирабического иммуноглобулина. Ежегодная потребность в
антирабическом иммуноглобулине лечебно-профилактических организаций страны составляет
около 550 литров и требует увеличения объема его производства.
Анализ потребности в антирабическом иммуноглобулине, проведенный с учетом годового объема
антирабической экстренной помощи (250-450 тыс. человек) и назначаемой дозировки 20 МЕ на 1
кг веса (в среднем 1200 МЕ на один курс) показывает, что потребность России в антирабическом
иммуноглобулине (терапевтическом антителе) составляет 420 млн. МЕ. Принимая во внимание
удельную активность терапевтического антитела 100 МЕ/мг, обеспечение годовой потребности
предполагает производство около 5 кг очищенных антител.Основными конечными потребителями результатов ПНИЭР при условии создания и регистрации
лекарственного средства на основе рекомбинантных человеческих
антител к ГП вируса бешенства являются учреждения Минздрава и Роспотребнадзора.
Создаваемый лекарственный препарат при условии его эффективности позволит заместить
лошадиный и человеческий сывороточные антирабические иммуноглобулины, что позволит
значительно повысить качество и доступность экстренной профилактики бешенства.