Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0140

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0140
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Название доклада
Создание персонифицированных препаратов на основе цитотоксических Т-лимфоцитов и дендритно-клеточных вакцин для профилактики и терапии рецидивов злокачественных новообразований
Докладчик
Чумаков Степан Петрович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Ключевой целью исследования является разработка нового подхода к адоптивной иммунотерапии с целью предотвращения развития рецидивов злокачественных новообразований путем формирования специфического противоопухолевого иммунитета. Задача проекта заключается в разработке и тестировании дендритно-клеточной противоопухолевой вакцины, полученной путем оптимизированной культивации дендритных клеток, введения в них конструкций, экспрессирующих опухолевые антигены и получения при помощи ко-культивации с ними больших количеств активированных Т-лимфоцитов, обладающих противоопухолевой активностью in vivo и обеспечивающих комплексную иммунную реакцию с образованием долгоживущих противоопухолевых клеток памяти.
Актуальность и новизна исследования
Наиболее распространенными причинами появления опухолевых антигенов считаются особенности метаболизма раковых клеток, использование раковыми клетками определенных путей передачи пролиферативных сигналов, а также геномные нарушения и перестановки, приведшие к малигнизации. Современная наука старается использовать каждую из этих причин для создания противоопухолевых средств. В ходе выполнения проекта впервые разрабатывается дендритно-клеточная противоопухолевая вакцина, полученная путем оптимизированной культивации дендритных клеток, введения в них конструкций, экспрессирующих опухолевые антигены и получения при помощи ко-культивации с ними больших количеств активированных Т-лимфоцитов, обладающих противоопухолевой активностью in vivo, и обеспечивающих комплексную иммунную реакцию с образованием долгоживущих противоопухолевых клеток памяти. Несомненно, что терапевтические методы на основе адоптивной иммунотерапии, сочетающие в себе высокую эффективность и избирательность действия на опухолевые клетки, станут новой ступенью персонализированного лечения онкопатологии. Однако, сейчас на пути массового внедрения адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований в клиническую практику стоит высокая стоимость конечного терапевтического продукта. Данный подход позволилит существенно снизить стоимость персонализированной иммунотерапии и ускорит проведение лечения онкологических больных, что будет способствовать увеличению выживаемости пациентов.
Описание исследования

Ключевая задача проекта - разработка и тестирование метода адоптивной иммунотерапии при помощи дендритноклеточных вакцин и цитотоксических лимфоцитов у пациентов, перенесших операцию по удалению злокачественного новообразования или курс химио-радиотерапии. Для её реализации было решено несколько промежуточных задач. В частности, получение дендритных клеток (ДК) или их предшественников от пациентов, когда в качестве источника предшественников ДК выступала моноцитарная фракция периферической крови. Моноциты периферической крови митотически неактивны, поэтому в их геном введены транскрипционные факторы с-MYC или BMI1, активирующие пролиферацию и способные повысить митотическую активность моноцитов. Данный подход снизил инвазивность при получении исходного иммунного материала от пациента и сделал процедуру доступной для тяжелых больных. Далее были сравнены два протокола культивации и дифференцировки моноцитов в ДК. Один основан на культивации CD14+ фракции клеток (моноцитов) с ростовыми факторами GM-CSF и IL-4, что приводит к их высокоэффективной дифференцировке в незрелые ДК. Второй подход – прямая инфекция CD14+ популяции лентивирусным вектором, несущим полицистронную кассету, экспрессирующую рекомбинантные GM-CSF и IL-4, что также ведет к образованию дендритных клеток (smartDC). В результате предпочтение отдано второму подходу. Параллельно проведен выбор эффективных носителей для доставки ДНК-конструкций в ДК. Приоритет отдан векторам на основе рекомбинантных лентивирусов, эффективность которых была дополнительно усилена доставкой в дендритные клетки одновременно с лентивирусным вектором псевдовирусных частиц, несущих ген Vpx вируса иммунодефицита обезьян. Проведена оптимизация доставки вирусных частиц в ДК путем использования для псевдотипирования вируса поверхностных гликопротеинов, обладающих сродством с рецепторами, представленными исключительно на поверхности дендритных клеток (DC-SIGN). Для этого использован модифицированный гликопротеин вируса Sindbis. Следующая задача - оптимизация экспрессии опухолевых антигенов в ДК и регулировании представленности целевых эпитопов на белках комплекса гистосовместимости MHC классов I и II. Проведено сравнение эффективности действия промоторов для экспрессии трансгена вирусной (CMV, SV40, MoMLV) и клеточной (EF1a, EEF1a, SAR) природы. Для каждой клеточной популяции (CD14+ моноциты, незрелые дендритные клетки, активированные дендритные клетки, CD8+ T- лимфоциты) определен промотор с лучшей экспрессией трансгена. Оценена эффективность сигналов лизосомной деградации на модельном опухолевом антигене MUC1, определена сигнальная последовательность, приводящая к его наилучшей загрузке в MHC II и способность зрелых дендритных клеток вызывать образование CD4+ активированных противоопухолевых Т-хелперов. Отработаны условия очистки фракции Т-лимфоцитов из периферической крови, их ко-культивации совместно со зрелыми дендритными клетками, оптимизирован состав «коктейля» цитокинов для созревания дендритных клеток. Получена клеточная линия-продуцент CD40L, фактора, эффективно индуцирующего созревание дендритных клеток. После отработки условий получения противоопухолевых активированных CTL проведено определение соотношения CD4+ и CD8+ фракций CTL методом проточной цитометрии. Эффективность противоопухолевого действия CTL оценена ex vivo на культурах клеток опухолевых линий, несущих антиген и in vivo на мышах с привитыми опухолями. Параллельно в Т-лимфоцитах будет экспрессирован белок апоптин с избирательным токсическим действием только на опухолевые клетки. В состав экспрессионной кассеты введены сигнальные последовательности для секреции из Т-лимфоцитов и трансдукции в опухолевые клетки. Разработанная методика будет протестирована на опухолевых антигенах MUC1, CEA, ARTC1, ETV6/AML1, HER2/neu, MAGE-A1. Для каждого будет изготовлена экспрессирующая конструкция, введена в дендритные клетки, получены CTL и проверено их действие на культурах клеток, несущих антиген, и на мышах с привитыми опухолями, после оценена эффективность действия в режиме терапевтического и профилактического действия. На первичных и линейных мышиных моделях опухолей будет испытан подход для выявления новых опухолевых антигенов методом глубокого секвенирования транскриптома опухолей и масс-спектрометрического анализа поверхностных белков. Будут идентифицированы опухолеспецифичные поверхностные антигены с перспективой испытания в качестве объектов для иммунизации дендритных клеток и генерации CTL.

Результаты исследования

В результате исследований на примере модельного антигена ERBB2 разработана методика получения ДНК-конструкций, кодирующих эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов (ОАА) с сигналами протеасомной деградации, необходимыми для их оптимальной загрузки на комплексы MHCII. На основании разработанной методики для проведения доклинических исследований были получены ДНК-конструкции, экспрессирующие опухоль-ассоцииированные антигены MUC1, CEA, AML1, MAGE-A1, ARTC1, способные к эффективной стимуляции противоопухолевого иммунного ответа. ДНК конструкции были наработаны в достаточном количестве и с достаточной чистотой. Для дальнейшего производства эффективных препаратов для экспрессии опухолевых антигенов в дендритных клетках были получены псевдовирусные частицы, содержащие белок Vpx вируса SIVmax.  В результате сравнения вариантов доставки ДНК-конструкций в дендритные клетки был отобран оптимальный носитель - лентивирусный вектор на основе ВИЧ-1 с введенным белком vpx вируса иммунодефицита обезьян (SIV) для инактивации клеточного белка SAMHD, препятствующего эффективной экспрессии лентивекторной кассеты. С помощью этого вектора произведена доставка ДНК-конструкций в дендритные клетки. В первичных клетках моноцитарной фракции проведено сравнение эффективности действия серии промоторов вирусной и клеточной природы путем введения с помощью лентивирусного вектора экспрессионных кассет с тестируемым промотором и геном tagRFP. Выявлено, что сильные промоторы клеточной природы вызывают более высокие уровни экспрессии репортерного гена, чем вирусные или тканеспецифические промоторы. В качестве оптимального выбран промотор EF1a. Произведена серия флуоресцентно-меченых зондов против последовательностей, характерных для конститутивной части лентивирусной экспрессионной кассеты. Выбраны области в рамках элементов WPRE, фрагментов cPPT и gag. Для каждого элемента создано по 4 различных варианта флуоресцентно-меченых зондов, каждый вариант независимо гибридизован с флуорофором FAM либо Cy5. На клетках линии THP-1, дифференциированных в дендритные коктейлем цитокинов, показано, что рекомбинантные вирусные частицы на основе лентивирусного вектора, псевдотипированные гликопротеином вируса Sindbis E1001, лучше избирательно заражают дендритные клетки, чем вирусные частицы, псевдотипированные VSV-G. Оценка эффективности сигналов лизомной деградации на опухолевом антигене Her2/neu привела к выбору варианта сигнала, представляющего собой фрагмент инвариантной цепи Ii, сочетающий высокую эффективность нацеливания опухолевого антигена в лизосомы и удобство введения в конструкты, что ведет к его наилучшей загрузке на MHC II. Тестирование способности зрелых дендритных клеток вызывать образование CD4+ активированных противоопухолевых Т-хелперов на культуре клеток HCC1954, гиперэкспрессирующих Her2/neu, показало, что цитотоксическая активиность Т-лимфоцитов, полученных из фракции периферических мононуклеарных клеток методом магнитной селекции, превосходит активность лимфоцитов, активированных дендритными клетками после обработки цельным лизатом опухолевых клеток.  Получено высокоаффинное антитело против рецептора DC-SIGN. Синтезированы промоторные области и сигналы лизосомной локализации. Все полученные результаты обладают научной ценностью, новизной и являются конкурентноспособными по сравнению с аналогичными работами мирового уровня.

Практическая значимость исследования
Основной результат проекта будет востребован в медицинских учреждениях, специализирующихся на терапии онкологических заболеваний. Созданная дендритно-клеточная вакцина будет предназначена для осуществления адоптивной иммунотерапии с использованием цитотоксических Т-лимфоцитов или для проведения конкурентной терапии вместе с химио- или радиотерапевтическим лечением таких опухолей. Фундаментальные и прикладные результаты проекта будут востребованы биотехнологическими компаниями и научными коллективами в ходе проведения испытаний, связанных с поиском новых противораковых препаратов и сравнительной оценкой их эффективности действия, а также могут послужить основой для разработки новых, более эффективных комплексных подходов к терапии злокачественных опухолей и дать начало широкому применению в медицине терапевтических средств на основе белковых молекул.
Постер

14.607.21.0140.ppt