Регистрация / Вход
Прислать материал

14.578.21.0201

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.578.21.0201
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский технологический университет "МИСиС"
Название доклада
Разработка платформенной технологии доставки терапевтических миРНК в печень
Докладчик
Мажуга Александр Георгиевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель проекта: Разработать универсальную технологию эффективной доставки терапевтических миРНК в составе липидоподобных наночастиц в печень и получить препарат, содержащий липидоподобные частицы с включенными миРНК и магнитными наночастицами для терапии гиперлипидемии.

Задачи:
1. Получение наночастиц магнетита различного размера и морфологии.
2. Синтез липидоподобных молекул.
3.Синтез миРНК.
4. Получение липидоподобных наночастиц, содержащих терапевтические миРНК и магнитные наночастицы.
4.1. Модификация магнитных наночастиц.
4.2. Модификация липидоподобных наночастиц миРНК к мРНК аpoB.
5. In vitro исследование липидоподобных частиц, содержащих наночастицы магнетита.
6. In vivo исследование липидоподобных частиц, содержащих наночастицы магнетита.
6.1. Оценка эффективности доставки липидоподобных магнитных наночастиц в целевой орган методом МРТ.
6.2. Исследование накопления препарата на основе липидоподобных частиц, содержащих магнитные наночастицы в печени.
7. Исследование эффективности ингибирования экспрессии аpoB под действием липидоподобных частиц, содержащих наночастицы магнетита и миРНК к мРНК ароВ в условиях экспозиции в низкочастотном магнитном поле.
8. Исследование механизма эндоцитоза липидоподобных частиц, содержащих наночастицы магнетита и миРНК к мРНК ароВ, на живых клетках методом сканирующей ион-проводящей микроскопии (СИПМ).
поверхности плазматической мембраны.
9. Исследование препарата для терапии гиполипидемии in vivo.
10. Разработка платформы для синтеза липидоподобных частиц, содержащих наночастицы магнетита и миРНК к мРНК ароВ, на основе микрофлюидных технологий.
Актуальность и новизна исследования
Малые интерферирующие РНК (миРНК) – класс двухцепочечных РНК, которые после образования комплекса с рядом белков, вызывают деградацию комплементарных матричных РНК (мРНК). Целенаправленное подавление экспрессии генов с помощью миРНК в клетках эукариот носит временный характер, особенно в быстро делящихся клетках. В настоящее время терапия с использованием миРНК является одним из наиболее перспективных направлений [Bakhtiyari S, Therapeutic Delivery, 2013, 4, 1 , 45-57]. На сегодня не менее 80 препаратов на основе нуклеиновых кислот проходят различные стадии клинических испытаний для терапии онкологических патологий, вирусных инфекций, диабета, гиперхолестеринимии, глаукомы и др. [Delivery materials for siRNA therapeutics, Nature Materials,12, 967–977 (2013)]. В качестве терапевтического агента миРНК имеют ряд преимуществ по сравнению с низкомолекулярными соединениями, поскольку достаточно доставить лишь несколько сотен молекул в клетку для достижения терапевтического эффекта. В тоже время есть значительные ограничения, связанные с относительно невысокой стабильностью миРНК, сложностью адресной доставки и неэффективным выходом миРНК из эндосом в цитозоль клетки. Сегодня для адресной доставки миРНК в качестве носителя используют наночастицы металлов, оксидов металлов и неметаллов, полимеры, липиды и гидрогели. Системы на основе наночастиц рассматриваются как альтернатива классическим методам из-за ряда преимуществ. Среди них - высокая биосовместимость, возможность добиться специфического биораспределения благодаря широким возможностям модификации наночастиц, эффективная защита миРНК от деградации.
Описание исследования

Универсальная платформенная технология доставки терапевтических миРНК основана на использовании наночастиц, содержащих три необходимых компонента: терапевтическая миРНК, липидоподобные молекулы, наночастицы магнетита. Для разработки данной технологии будет решен ряд логически связанных задач:
1. Будут получены образцы магнитных наночастиц (МНЧ) различной формы, имеющие на поверхности гидрофобные фрагменты олеиновой кислоты. 
2. Из необходимых молекул для получения липидоподобных наночастиц единственно коммерчески недоступным материалов является липид (C12-200). Ключевой стадией синтеза липида С12-200 является взаимодействие N-1-(2-(4-(2-аминоэтил)пиперазин-1-ил)этил)этан-1,2-диамина с избытком 1,2-эпоксидодекана.
3. В качестве миРНК к мРНК ApoB будет использован дуплекс миРНК следующего строения: GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA/ uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCccsU. Для визуализации процессов трансфекции липидоподобных частиц, содержащих миРНК будет синтезирована последовательность uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCccUF, где F является флуорофором. Данные миРНК будут синтезированы с использованием автоматизированного олигонуклеотидного синтезатора по амидофосфитной схеме с использованием коммерчески доступных реагентов.
4. Синтез липидоподобных наночастиц, содержащих терапевтические миРНК и магнитные наночастицы будет осуществлен в две стадии: Для получения целевых липидоподобных наночастиц, содержащих магнетит будет использована процедура фазового переноса. Модификация магнитных наночастиц смесью холестерина и липидов будет проведена так же в условиях смешивания в ламинарных потоках. Будет получена серия образцов с различным содержание миРНК на поверхности наночастиц. Количество адсорбировавшейся миРНК будет определено с применением красителя RiboGreen. 
5. Для оценки безопасности разрабатываемых наночастиц будет оценена токсичность на клеточном уровне. Помимо цитотоксичности будут оценены параметры индуцированного гемолиза, агрегации тромбоцитов, фагоцитоза (на примере лейкоцитов человека, крысы, мыши).
6. In vivo исследование липидоподобных частиц, содержащих наночастицы магнетита. При проведении МРТ исследования животных до и после введения липидоподобных магнитных наночастиц по изменению интенсивности сигнала от целевого органа на МРТ изображение будет возможно выявить времена на которых происходит наибольшее накопление исследуемого препарата и его специфичность по отношению к другим органам. Будут выбраны образцы липидоподобных частиц, содержащих наночастицы магнетита, обладающие наименьшей цитотоксичностью, наилучшими контрастными средствами обеспечивающие наилучшую доставку в печень которые будут модифицированы миРНК к мРНК apoB.
7. Исследование эффективности ингибирования экспрессии аpoB под действием липидоподобных частиц, содержащих наночастицы магнетита и миРНК к мРНК ароВ в условиях экспозиции в низкочастотном магнитном поле. Ключевой задачей проекта является использование низкочастотного магнитного поля для улучшения трансфекции терапевтических миРНК. Нами впервые предлагается исследовать процесс трансфекции миРНК внутрь клеток под действие низкочастотного магнитного поля (10-50Гц), будут оптимизированы оптимальные параметры поля, такие как напряженность и частота, а также время экспозиции. Процесс трансфекции планируется исследовать методом ПЦР по количеству аpoB в лизатах после трансфекции. 
8.  Для исследования механизма эндоцитоза будет проводиться исследование топографических особенностей клетки при взаимодействии липидоподобными частицами, содержащими наночастицы магнетита и миРНК к мРНК ароВ, с помощью сканирующей ион-проводящей микроскопии и сопоставление полученных результатов с данными флуоресцентной конфокальной микроскопии, полученные одновременно, а именно выявление связи между динамикой процесса эндоцитоза и выступами/впадинами поверхности плазматической мембраны.

9. Эффективность ингибирования экспрессии ароВ in vivo будет оценена на здоровых лабораторных животных. Для этой цели животным будет внутривенно введен препарат, содержащий миРНК к мРНК ароВ, через 24 часа будет выделена печень. Наибольший интерес для терапии среди клеток печени представляют гепатоциты (50% по количеству), в которых методом ПЦР в реальном времени будет оценен уровень экспрессии ароВ. Будет продемонстрирован доза зависимый эффект.
10.  В рамках настоящего проекта планируется разработать систему, которая будет проводить полуавтоматический синтез липидоподобных частиц, содержащих наночастицы магнетита и миРНК к мРНК ароВ, с использованием микрофлюидных чипов.

Результаты исследования

Основным результатом выполнения ПНИЭР будет универсальная технология эффективной доставки терапевтических миРНК в составе липидоподобных наночастиц в печень будет востребована российскими и международными научно-исследовательскими центрами, занимающимися разработкой терапевтических препаратов для лечения патологий печени. Разрабатываемый препарат, содержащий липидоподобные частицы с включенными миРНК и магнитными наночастицами для терапии гиперлипидемии будет востребован различными медицинскими учреждениями и пациентами с сердечно-сосудистыми заболеваниями, панкреатитом, развившихся на фоне повышенного уровня холестерина. Подробный перечень научных и научно-технических результатов, подлежащих получению при
выполнении ПНИЭР:

Технология эффективной доставки терапевтических миРНК в составе липидоподобных наночастиц в печень и получить препарат, содержащий липидоподобные частицы с включенными миРНК и магнитными наночастицами для терапии гиперлипидемии;
Экспериментальные образцы липидоподобных частиц с включенными миРНК и магнитными наночастицами для терапии гиперлипидемии:
А) Экспериментальные образцы липидоподобных наночастиц с включенными миРНК и сферическими магнитными наночастицами для терапии гиперлипидемии – далее Образец 1;
Б) Экспериментальные образцы липидоподобных наночастиц с включенными миРНК и кубическими магнитными наночастицами для терапии гиперлипидемии – далее Образец 2;
Методика получения Образца 1 с использованием стандартного лабораторного оборудования;
Методика получения Образца 2 с использованием стандартного лабораторного оборудования;
Методика получения Образца 1 с использованием экспериментального образца микрофлюидного чипа;
Методика получения Образца 2 с использованием экспериментального образца микрофлюидного чипа;
Лабораторный технологический регламент получения Образца 1;
Лабораторный технологический регламент получения Образца 2;
Методика синтеза липида C12-200;
Методика получения липидоподобных магнитных наночастиц;
Экспериментальный образец микрофлюидного чипа для получения Образца 1 и Образца 2;
Эскизная конструкторская документация на экспериментальный образец микрофлюидного чипа для получения Образца 1 и Образца 2;
Лабораторные образцы липидоподобных магнитных наночастиц;
Методика визуализации проникновения в единичные клетки Образца 1 и Образца 2 на основе сканирующего ион-проводящего микроскопа с интегрированной конфокальной микроскопией;
Методика визуализации проникновения в единичные клетки липидоподобных магнитных наночастиц на основе сканирующего ион-проводящего микроскопа с интегрированной конфокальной микроскопией;
Программа и методики исследовательских испытаний экспериментальных Образцов 1 и Образцов 2;
Программа и методика исследовательских испытаний лабораторных образцов липидоподобных магнитных наночастиц;
Отчет о маркетинговых исследованиях;
Заявки на получение охранного документа (патента);
Публикации по результатам исследований и разработок в научных журналах.
Методика оценки цитотоксичности экспериментальных образцов 1 и 2 в экспериментах in vitro;
Проект Технического задания на проведение НИОКР по теме: «Доклинические исследования терапевтических миРНК в составе липидоподобных наночастиц для терапии гиперлипидемии».
Методика проведения трансфекции миРНК с помощью липидоподобных частиц под действием магнитного поля

Практическая значимость исследования
Ранее было показано, что липидоподобные частицы, не содержащие магнитных наночастиц, являются оптимальными системами для доставки миРНК [Kotelyanskiy V.E. etc., Nature, 2010, 466, 7307, 714]. Так была подобрана оптимальная композиция состоящая из холестерина, липидоподобного ПАВ аддуктаN-1-(2-(4-(2-аминоэтил)пиперазин-1-ил)этил)этан-1,2-диамина с избытком 1,2-эпоксидодекана (C12-200), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина(DSPC) и 1,2-димиристоил-sn-глицеролополиэтиленгликоля монометиловый эфир (DMG-mPEG). Терапевтический потенциал такой системы огромен и позволяет доставлять различные по строению миРНК, отвечающие за нокдаун целевых генов в печень [Marija Tadin-Strapps, J Lipid Res. 2011 Jun; 52(6): 1084–1097]. Именно этим фактором и выбран круг заболеваний, поддающихся терапии с использованием предлагаемых липидоподобных частиц, содержащих магнитные наночастицы и миРНК. Метаболические заболевания печени, наряду с онкологическими патологиями данного органа, являются социально-значимыми заболеванием в Российской Федерации. Для апробации предлагаемого подхода в настоящем проекте предлагается создать препарат для терапии метаболического заболевания – гиперлипидемии. Гиперлипидемия, заболевание при котором аномально повышается уровень липидов или липопротеидов в крови человека. Нарушения липидного обмена являются одним из важнейших факторов риска развития и прогрессирования сердечно-сосудистых заболеваний. Именно поэтому своевременная и правильная диагностика дислипидемий необходимый компонент рациональной профилактики и терапии атеросклероза в разных группах больных, а степень агрессивности лечения должна определяться выраженностью сердечно-сосудистого риска.
Впервые будет создана технология получения препаратов, содержащих миРНК и получен препарат для терапии гиперлипидемии, содержащий в своем составе следующие компоненты:
1. миРНК, отвечающая за подавление экспрессии генов apoB.
2. МНЧ, отвечающие за магнитоуправляемое высвобождение миРНК из эндосом. МНЧ могут применяться для адресной доставки миРНК в пораженный орган применяя внешнее магнитное поле
3. липидоподобную оболочку на поверхности наночастиц, обеспечивающую стабильность магнитных наночастиц, возможность иммобилизации миРНК, и доставку в печень.