Регистрация / Вход
Прислать материал

14.616.21.0002

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.616.21.0002
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук"
Название доклада
Новые экспрессионные системы для высокопродуктивной гетерологичной экспрессии бактериальных экзо-ферментов, востребованных промышленной биотехнологией
Докладчик
Синицын Аркадий Пантелеймонович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целью проведенных научных исследований являлось получение детектируемого уровня экспрессии целевых бактериальных целлюлаз бактерий Clostridium thermocellum в эукариотических системах экспрессии низших грибов двух родов - Penicillium и Aspergillus, а также системе экспрессии бактерий рода Bacillus. Задачи завершающего этапа научных исследований состояли в: 1) оптимизации схемы культивирования рекомбинантных штаммов микромицетных грибов Penicillium и Aspergillus с экспрессией генов клостридиальных термофильных целлюлаз, 2) выделении очищенных рекомбинантных целлюлаз, 3) определении возможности эффективного связывания очищенных рекомбинантных бактериальных целлюлаз с другими компонентами клостридиальной целлюлосомы in vitro.
Актуальность и новизна исследования
Основной вклад в стоимость технических сахаров при их производстве из целлюлозосодержащего сырья (ЦСС) вносят ферменты и ферментные препараты целлюлаз. Проблему снижения затрат на производство ферментных препаратов, участвующих в процессах биоконверсии ЦСС, можно решать либо за счет повышения продуктивности микроорганизмов, производящих необходимый фермент или комплекс ферментов, либо осуществляя скрининг новых микроорганизмов, продуцирующих новые ферменты с уникальными свойствами, отвечающими потребностям эффективных технологических процессов конверсии ЦСС.
В Техническом Университете Мюнхена разработаны новые ферментативные системы, которые имитируют бактериальные ферментные комплексы целлюлаз из термофильной бактерии Clostridia thermocellum, характеризующиеся большей эффективностью в процессах биодеградации ЦСС. Однако, получение индивидуальных бактериальных целлюлаз в системах экспрессии бактерий и дрожжей приводит либо к получению каталитически неактивной формы фермента, либо к недостаточной продукции целевого белка.
Поэтому актуальной задачей представляется использование эукариотической системы экспрессии грибов Penicillium canescens, разработанной и оптимизированной ранее в лаборатории Биотехнологии ферментов ФИЦ Биотехнологии РАН, для получения бактериальных целлюлаз типов Cel48S, Cel5L, Cel9R и Cel9T, отличающихся широкой специфичностью действия по отношению к целлюлозе.
Следует отметить, что до настоящего момента в научно-технической и патентной литературе отсутствуют данные по экспрессии термофильных клостридиальных целлюлаз в системах экспрессии низших грибов.
Описание исследования

Объектом разработки является эукариотическая система экспрессии, позволяющая получить экспрессию бактериальных генов в низших грибах рода Aspergillus и Penicillium. Новизна разработки состоит в попытке экспрессии уникальных термофильных целлюлаз, являющихся компонентами целлюлосомы грам-положительной бактерии Clostridia termocellum в разработанной и высокопродуктивной экспрессионной системе низших грибов.

Таким образом, целью проекта является создание новых продуктивных рекомбинантных штаммов микроорганизмов, продуцирующих технические ферменты-бактериальные целлюлазы, обладающие уникальными свойствами при гидролизе целлюлозосодержащего сырья (ЦСС) при совместном участии российских и немецких партнеров.

Первый год работы был посвящен теоретическому обоснованию проводимых работ: был проведен аналитический  обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, относящейся к теме экспрессии гетерологичных генов в эукариотических системах, разработаны методики трансформации лабораторных штаммов-реципиентов грибов родов Penicillium и Aspergillus, проведены патентные исследования на тему: Штамм мицелиального гриба Penicillium canescens (и Aspergillus awamori) как основа для получения ферментных препаратов целлюлаз бактериального происхождения, провредены биоинформатические исследования структуры генов бактериальных целлюлаз и оптимизирована их структура для результативной экспрессии в грибных реципиентах.

Второй год работы над проектом состоял в получении грибных рекомбинантных штаммов-продуцентов бактериальных целлюлаз в реципиентах Penicillium canescens и Aspergillus awamori и их скрининге.  Данная работа была проведена для четырех генов целлюлаз celS, celR, celL и celT, кодирующих соответствующие белки CelS (целлобиогидролаза, 83 кДа), CelR (процессивная эндоглюканаза, 85 кДа, CelL (процессивная целлобиозидаза, 58 кДа) и CeLT (эндоглюканаза, 69 кДа). Однако, клонирование в реципиент Aspergillus awamori оказалось нерезультативным вследствии собственной высокой протеолитической активности штамма, поэтому в дальнейшем, работы велись с рекомбинантами Penicillium canescens, где впервые удалось добиться результативной экспрессии клостридиальных генов. Во второй год работы также проводилась подборка и оптимизация ферментационных сред культивирования рекомбинантных штаммов, поскольку стабильность экспрессии бактериальных целлюлаз являлось одной из основным задач проекта. 

Задачи третьего года  проекта состояли в выделении гомогенных целлюлаз из культуральной жидкости, секретируемой рекомбинантными штаммами, сравнении свойств нативных и рекомбинантных целлюлаз, оптимизация культивирования рекомбинантных штаммов в ферментерах с объемом 10-л. Одной из отдельных решаемых задач 4-ого и 5-ого Этапов являлось получение сухих и жидких форм ферментных препаратов, а также их стабилизация. На основании данных, полуенных в 2014-2016 гг был разработан Лабораторный регламент получения ферментных препаратов бактериальных целлюлаз.

Следует отметить, что Иностранный партнер работал по аналогичному плану, однако, задачей ИП являлось получение экспрессии в системе бактериального реципиента Bacillus subtilis. В Техническом Университете Мюнхена было проведено клонирование трех генов бактериальных целлюлаз- celA, celS и celR и получена экспрессия трех соответствующих белков. 

Результаты исследования

1. Были синтезированы синтетические гены celS, celL, celR и celT, кодирующие соответствующие белки, и сконструированы плазмиды, в которых экспрессия celS, celL, celR и celT контролируется сильным индуцибельным промотором ксиланазы А (xylA). Плазмиды были трансформированы в протопласты реципиентного гриба Penicillium canescens RN3-11-7, полученные рекомбинантные штаммы проанализированы на наличие гетерологичной экспрессии. В случае белков Сel48S и СelL наблюдалась экспрессия, оценочный уровень которой составил 20 и 5%, соответственно, от общего уровня секретируемого белка.

2. Была проведена очистка бактериальных целлюлаз CelS, CelR и СelL хроматографическими методами. Было показано, что лучшим способом выделения бактериальных целлюлаз является комбинация анионообменной и гидрофобной хроматографии по методике, разработанной ранее в лаборатории. Применение аффинной хроматографии в случае экспрессии целевых белков с гистидиновым эпитопом не привело к ожидаемым результатам.

3. Принадлежность экспрессируемых белков к своим семействам гликозилгидролаз было доказано методами масс-спектрометрии. Однако, стоит отметить, что секретируемые бактериальные целлюлазы были подвержены частичному протеолитическому расщеплению собственными протеазами гриба Penicillium canescens. Однако, это не повлияло на ферментативную активность индивидуальных целлюлаз.

4. Были проведены эксперименты по связыванию скаффолд-белка (белка-подложки, являющегося матриксом для организации клостридиальных целлюлаз in vivo). Показано, что в случае целлюлаз CelS, CelR, CelL и CelT связывание происходит с С-концевым доменом экспрессированных целлюлаз, что не влияет на ферментативную активность целевых белков.

5. Были проведены оптимизационные эксперименты по культивированию рекомбинантных штаммов в 10-л ферментерах. Было показано, что данный процесс линейно масштабируем при переходе от 1-л в 10-л ферментеры. Показано также, что ферментация данного типа рекомбинантных штаммов-продуцентов требует добавления ионов Ca2+  в концентрации 10мМ.

 

Практическая значимость исследования
Большинство ферментных препаратов гидролитического типа производится на основе штамма микромицетного гриба рода Trichoderma, широко используются также экспрессионные системы низших грибов рода Penicillium, Aspergillus, а также системы бактерий рода Bacillus. Большинство общеизвестных промышленных штаммов- продуцентов целлюлаз являются собственностью компаний-производителей ферментных препаратов. Поэтому поиск новых экспрессионных систем, позволяющих получать агрессивный комплекс высокоэффективных гидролитических ферментов по отношению к полисахаридам растительного сырья представляется важной и актуальной задачей.
В этом смысле целлюлазы ферментного комплекса, продуцируемого бактериями Clostridia thermocellum, не были использованы ранее для применения в промышленных масштабах. На сегодняшний момент это связано с отсутствием продуктивной системы экспрессии, обеспечивающей адекватный выход целевых целлюлаз.
Создание высокоэффективной системы экспрессии бактериальных целлюлаз будет иметь огромное прикладное значение, расширяя панель промышленных ферментных препаратов гидролитического спектра действия и создавая здоровую конкуренцию на мировом рынке ферментных препаратов целлюлаз.
В настоящее время российский рынок ферментных препаратов в РФ представлен продукцией зарубежных производителей ферментов более чем на 80%, остальные менее 20% рынка заполнены продукцией российских предприятий. В структуре рынка основную роль играют ферменты-карбогидразы (целлюлазы, ксиланазы и др).
Реализация предлагаемого, совместного с немецкими партнерами, проекта, помимо разработки инновационного подхода в части ферментативного гидролиза ЦСС, предполагает разработку высокоактивных штаммов-продуцентов ферментов-целлюлаз бактериального происхождения и получение на их основе высокоэффективных ферментных препаратов для использования в процессах биоконверсии ЦСС с получением продуктов- простых сахаров для дальнейшего использования их в процессах микробиологической конверсии.