Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0069

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0069
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Название доклада
Создание новых рекомбинантных биокатализаторов с потенциальными фармакологическими свойствами методами комбинаторной биологии
Докладчик
Габибов Александр Габибович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Создание на основе генов иммуноглобулинов и ферментов биокатализаторов с заранее заданными улучшенными свойствами для обеспечения их пролонгированной работы в токе крови в качестве лекарственных средств или использования в биотехнологии.
На данном этапе работы были поставлены следующие задачи исследования для решения вышеозначенной цели:1) разработать лабораторную методику получения штаммов-продуцентов, наработки, выделения и очистки лучших вариантов рекомбинантных биокатализаторов; осуществить наработку экспериментальных партий лучших вариантов биокатализаторов;
2) провести химическое полисиалирование в препаративных масштабах и наработку экспериментальных партий лучших вариантов химически полисиалированных биокатализаторов;
3) провести физико-химические исследования новых биокатализаторов;
4) провести дополнительные патентные исследования;
5) провести исследования биологической активности получаемых в ходе ПНИ препаратов.
Актуальность и новизна исследования
Задачи биотехнологии и фундаментальные проблемы биокатализа делают актуальным проблему создания новых биокатализаторов, способных превращать биополимеры и взаимодействовать с фосфорорганическими веществами, аналогами отравляющих веществ (ОВ).
В проекте с помощью высокоэффективных скрининговых технологий получаем биокатализаторы широкой специфичности при обязательном условии создания стабильных биокатализаторов с улучшенными фармакокинетическими параметрами с помощью платформы полисиалирования рекомбинантных белков. Для создания широких репертуаров генетической информации и скрининга белковых продуктов генов наряду с известными системами фагового дисплея в последние годы активно применяются системы клеточного дисплея. Система экспрессии рекомбинантных белков в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris зарекомендовала себя как удобный, сравнительно недорогой и технически доступный способ получения рекомбинантных белков: система экстраклеточной экспрессии позволяет получать ограниченное количество секретируемых белков, что существенно облегчает очистку рекомбинантного продукта и позволяет анализировать активность биокатализатора непосредственно на поверхности дрожжевой клетки. Безусловным преимуществом дисплея в дрожжевых системах является возможность автоматического скрининга клонов с помощью методов проточной цитофлуориметрии и технологии микрофлюидики при использовании детекции функциональной активности биокатализаторов методом флуоресцентной спектроскопии.
Описание исследования

Традиционным методом модификации структуры белка является неспецифический мутагенез с последующим отбором мутантов с необходимыми характеристиками для того или иного фермента. Но в последние годы появились более направленные методы. Детальное знание структуры ферментов, относительно простые процедуры выделения гена фермента, развитие методов генетической инженерии белков обеспечили возможность существенной модификации ферментов с получением белков с новыми свойствами. Используемые в этой области методы условно можно разделить на две группы:

1)           методы, основанные на статистической замене аминокислот с последующим отбором мутантов (комбинаторные методы);

2)           рациональные методы, использующие сведения о третичной структуре фермента и позволяющие направленно изменять те или иные фрагменты белковой молекулы.

Использование комбинаторных методов, основанных на создании большого массива возможных вариантов структур, особенно эффективно в случае модификации ферментов на уровне гена. Суть подходов, получивших название направленной эволюции, заключается в проведении случайных замен на уровне генов с последующим отбором мутантных вариантов, отвечающих цели улучшения свойств фермента. Методы проведения случайной замены разнообразны. Они включают «перетасовку» фрагментов ДНК, укорачивание гена по отдельным фрагментам, наращивание цепи со случайными ошибками. Полученные в результате этих процедур библиотеки ДНК вводят в вектора, например, плазмиды, и трансформируют библиотекой плазмид клетки. Последующий скрининг колоний по тому или иному признаку позволяет отобрать клетки, содержащие ферменты с нужным свойством. Отобранный ген и, соответственно, белок могут быть подвергнуты повторному раунду мутагенеза и селекции и, тем самым, может быть проведено дальнейшее улучшение характеристик фермента.

Рациональные подходы основаны на анализе трехмерной структуры белка с выявлением перспективных замен, способных существенным образом повлиять на свойства активного центра фермента или белка в целом.

Методы проведения работы:  генной инженерии, биотехнологии, белковой химии, хроматографии, масс-спектрометрии, ЯМР и масс-спектрометрии, иммуноферментного анализа,  поверхностного плазмонного резонанса.

На предыдущем третьем этапе были созданы библиотеки активных центров биокатализаторов бутирилхолинэстеразы человека (БуХЭ) и энтерокиназы человека (ЭК), а также каталитического антитела, специфичного к фосфорорганическим токсинам А 17. Была разработана лабораторная методика скрининга библиотек активных центров биокатализаторов методом проточной цитофлуориметрией - сортингом (FACS) в эмульсионной системе вода/масло/ вода, на основании которой был проведен скрининг библиотек активных центров БуХЭ и антитела A17 с последующим структурно-функциональным анализом отобранных клонов. Была разработана лабораторная методика получения химически полисиалированых рекомбинантных  биокатализаторов, а также проведен анализ фармакодинамических свойств, полученных полисиалированых биокатализаторов.

Полученные результаты явились платформой для выполнения исследований 4 этапа.

При выполнении 4 этапа Соглашения  были проведены наработка и физико-химические исследования новых рекомбинантных биокатализаторов, проведение исследований биологической активности получаемых в ходе создание новых рекомбинантных биокатализаторов:

1) разработка лабораторной методики получения штаммов-продуцентов, наработки, выделения и очистки лучших вариантов рекомбинантных биокатализаторов; наработка экспериментальных партий лучших вариантов биокатализаторов;

2) химическое полисиалирование  в препаративных масштабах и наработка экспериментальных партий лучших вариантов химически полисиалированных биокатализаторов;

3) физико-химические исследования новых биокатализаторов;

4) дополнительные патентные  исследования;

5) исследования биологической активности получаемых в ходе ПНИ препаратов.

Результаты исследования

По итогам выполнения четвертого этапа работы, направленной на наработку и физико-химические исследования новых рекомбинантных биокатализаторов, а также исследования биологической активности получаемых в ходе исследований препаратов  получены следующие основные результаты:

1. Разработаны лабораторные методики получения штаммов-продуцентов, наработки, выделения и очистки лучших вариантов рекомбинантных биокатализаторов и  представлены в комплекте отчетной документации по этапу. Наработаны экспериментальные партии лучших вариантов мутантных Fab-фрагментов: мутанта L-L47R –  20.8 мг, мутанта L-L47K – 12.3 мг (оба препарата c чистотой не менее 95%). Наработаны экспериментальные партии лучших вариантов рекомбинантной бутирилхолинэстеразы: рекомбинантной БуХЭ – 50 мг, мутанта БуХЭ-14 – 15 мг (оба препарата c чистотой не менее 95%).

2. Наработаны экспериментальные партии полисиалированных бутирилхолинэстеразы БуХЭ-ПСА24 и её мутантной формы БуХЭ-14-ПСА24. В результате получено 56 мг БуХЭ-ПСА24 и 19.6 мг БуХЭ-14-ПСА24 при сохранении специфической удельной активности 82% и 72%, соответственно (оба препарата c чистотой не менее 95%).

3. Были проведены исследования по оценке физико-химических свойств биокатализаторов. Установлено, что антитела L-L47R и L-L47K можно отнести к биологическим антидотам классического типа (не каталитическим) и рассматривать их как эффективные акцепторы параоксона, причем антитело L-L47K – лучший кандидат каталитического антитела для проведения биологических испытаний. Полученные данные свидетельствуют, что клон БуХЭ-14 является каталитическим антидотом.

4. На данном этапе дополнительного патентного поиска установлено, что объект патентования – способ конъюгации тетрамерной бутирилхолинэстеразы человека и полисиаловой кислоты различных молекулярных масс для терапии отравлений фосфорорганическими соединениями – нигде не описан и не является частью уже существующего решения.

5. Проведены эксперименты по оценке потенциального защитного действия препаратов новых биокатализаторов при остром отравления ФОВ на животной модели. Для экспериментов были использованы самки мышей - 102 животных. Для исследований использовались разработанные в рамках проекта препараты полисиалированной бутирилхолинэстеразы БуХЭ-ПСА24 и каталитического антитела A17 L-L47K. В результате работы были определены фармакокинетические параметры для антитела A17 L-L47K, которые составили: t1/2распр. = 10±2 ч., t1/2вывед. = 640±60 ч. Было установлено, что оптимальной дозой параоксона является доза 550 мкг/кг на фоне предварительного  введения ингибитора карбоксилэстеразы CBDP в дозе 1.5 мг/кг. Расчетным методом были предложены дозы БуХЭ-ПСА24 (91 мг/кг) и A17 L-L47K (61 мг/кг) для исследования потенциального защитного эффекта при исследовании на модели острого отравления ФОВ. Для БуХЭ-ПСА24 было установлено, все животные получившее препарат выжили,  клинические проявления отравления наблюдались не более трех минут.

Практическая значимость исследования
Практическим результатом является создание "каталитически активного антидота" к фосфорорганическим ОВ. Получение потенциальных лекарственных средств пролонгированного действия. Функциональный скрининг библиотек генов создает системы экспрессии кодируемых ими белков и детекции активности последних. В данном проекте решается задача экспрессии репертуара генов, кодирующих биокатализаторы на поверхности клеток дрожжей P. pastoris и системы отбора биокатализаторов с оптимальными заранее заданными свойствами. Возможные потребители результатов исследования: Минпромторг РФ, Минобороны РФ, МВД РФ, МЧС РФ, Минздрав РФ, университеты и вузы РФ, Научно-исследовательские профильные институты, фармацевтические компании.