Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0043

Аннотация скачать
Постер скачать
Презентация скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0043
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии"
Название доклада
Получение персонализированных клеточных препаратов на основе антиген-активированных дендритных клеток и антиген-специфических Т лимфоцитов, предотвращающих рецидив опухоли.
Докладчик
Курилин Василий Васильевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Реализуемый проект направлен на разработку протоколов получения клеточных препаратов для персонализированной клеточной иммунотерапии эпителиальных форм онкологических новообразований на основе оригинального протокола культивирования дендритных клеток, который предполагает сократить сроки получения зрелых дендритных клеток и в последующем сократить сроки создания персонализированного клеточного препарата на основе зрелых антиген-активированных дендритных клеток и антиген-специфических Т-клеток.
Целью реализуемого проекта является разработка лабораторного регламента получения клеточных препаратов на основе антиген-активированных дендритных клеток и антиген-специфических Т-лимфоцитов для предотвращения рецидива опухоли.
Актуальность и новизна исследования
В настоящее время эффективность современной иммунотерапии и профилактики рецидивов неопластических процессов заключается в коррекции нарушений презентации антигена и генерации антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов. Ключевая роль в активации противоопухолевого клеточного иммунитета принадлежит дендритным клеткам (ДК), которые распознают и представляют антигены в комплексе с молекулами HLA I и II класса Т- и В-лимфоцитам, экспрессируют большое количество молекул HLA I и II классов и ко-стимуляторных факторов (CD80, CD86), способствующих эффективной презентации ОАА.
Перспективным подходом к лечению рака является активная иммунотерапия, которая в настоящее время представляется неотъемлемой частью современной клинической практики. Поскольку главная цель иммунотерапии при онкологии заключается в обеспечении сильного и устойчивого опухолеспецифического иммунного ответа, достижение подобных результатов возможно через стимуляцию CD4+ и CD8+ Т-клеток. CD8+ Т-лимфоциты являются главными эффекторными клетками противоракового иммунного ответа, образование которых зависит от подходящего антигена-мишени и эффективной презентации данного антигена иммунной системе пациента с участием антигенпрезентирующих клеток (АПК). Дендритные клетки являются наиболее эффективными АПК и единственными клетками, способными представлять новые антигены неактивированным Т-клеткам. Поэтому применение аутологичных дендритных клеток, трансфицированных уникальными ДНК-вакцинными конструкциями, кодирующими искусственные полиэпитопные белки-иммуногены, представляет собой эффективный инструмент для презентации антигенов иммунной системе пациента.
Описание исследования

Для решения поставленных задач ПНИ на 2016 год был использован разработанный в 2015 году лабораторный регламент получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток (ДК) из прилипающей фракции моноцитов периферической крови больных немелкоклеточным раком легкого, колоректального рака и рака молочной железы. Полученные зрелые ДК трансфицировали ДНК-конструкциями согласно разработанной ранее методике доставки ДНК-конструкции с помощью магнитной трансфекции. ДНК-конструкции включали 323 эпитопа от 26 опухоль-ассоциированных антигенов.

Трансфицированные полученными ДНК –конструкциями ДК ссаживали с неприлипшей фракцией аутологичных МНК и культивировали в течение 4 суток в условиях СО2-инкубатора (5% СО2, 37оС, 100% влажность) в соотношении 1:10. Перед сокультивированием оценивали клеточный состав неприлипшей фракции МНК по маркерам CD3, CD4, CD8, CD19 и CD16/CD56, оценка содержания субпопуляций клеток проводилась методом проточной многоцветной цитофлюориметрии.

После сокультивирования оценивалась эффективность формирования специфического цитотоксического иммунного ответа в совместной культуре МНК и ДК против опухолевых клеток.

Опухолевые клетки получали путем механической и ферментативной дезагрегации опухоли, жизнеспособность полученных опухолевых клеток оценивали по окрашиванию эритрозином, она составляла не менее 50%.

Совместное культивирование исследуемых популяций ДК, трансфицированных ДНК-конструкциями, и неприлипшей фракции мононуклеарных клеток МНК проводилось в питательной среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, гентамицина 80 мкг/мл, 2мМ L-глутамина, 5х10-5 меркаптоэтанола. В качестве контроля использовали неприлипшую фракцию мононуклеарных клеток, культивированную в тех же условиях, а также сокультивированных с ДК, без процедуры трансфекции или с дендритными клетками, трансфицированными контрольной плазмидой, не кодирующей опухолевые антигены. Для оценки потенциальной возможности увеличить цитотоксическую активность культуры мононуклеарных клеток оценили эффект от добавления в совместную культуру МНК и ДК цитокинов IL-12 и IL-18, а также специфических ингибиторов IDO (1-метил-L-триптофан) и COX-2 (целекоксиб).

Для оценки цитолитической активности совместной культуры МНК и ДК использовали нерадиоактивный цитотоксический тест CytoTox96 (Promega, США), основанный на количественном определении содержания внутриклеточного фермента – лактатдегидрогеназы (ЛДГ), которое увеличивается пропорционально гибели опухолевых клеток. Процедуру осуществляли согласно протоколу фирмы-производителя. Гибель клеток-мишеней оценивали по высвобождению внутриклеточного фермента (лактатдегидрогеназы). Уровень цитотоксичности оценивали, как отношение оптической плотности в образце со смесью эффекторов и мишеней к оптической плотности в образце с полностью лизированными мишенями, выраженное в процентах. Учитывали поправки на присутствие ЛДГ в среде и спонтанный выход ЛДГ из эффекторов и клеток-мишеней (опухолевые клетки).

Для определения механизмов, определяющих цитотоксический эффект фракции МНК, активированных ДК, оценили ряд внутриклеточных, мембраносвязанных и растворимых факторов, которые описаны в литературе, как факторы, формирующие противоопухолевый иммунный ответ (IFN-γ, IL-4, IL-10, гранзим В, перфорин, Fas и TRAL) методами проточной цитофлуориметрии и иммуноферментного анализа.

Для разработки плана исследования клеточных препаратов на основе дендритных клеток были выбраны три различные модели опухолевой прогрессии, отличающиеся наличием первичных опухолевых узлов и метастазированием: аденокарциному Кребс-2 (далее Кребс-2), меланому В16 (далее В16) и карциному легких Льюис (далее LLC). Аденокарцинома Кребс-2 является неметастазирующей опухолью эпителиального происхождения, растущей в асцитной и солидной форме в мышах C57Bl/6J, и является аналогом злокачественных опухолей эпителиального происхождения железистого типа у человека. Было разработано шесть планов: по две схемы лечения (профилактическая, терапевтическая) для каждой из трех опухолевых моделей (аденокарцинома Кребс-2, карцинома легких Льюис, меланома В16).

Результаты исследования

По завершению проекта ПНИ разработаны лабораторные регламенты получения активированных мононуклеарных клеток, обладающих цитотоксической активностью против опухолевых клеток колоректального рака, немелкоклеточного рака легкого и рака молочной железы, при использовании зрелых дендритных клеток, трансфицированных разработанной ДНК-конструкцией, уровень цитотоксического ответа составил соответственно 67,4%, 57,2% и 51,3%. Оценка факторов цитотоксичности (Fas, TRAIL, перфорин, гранзим В) и продукции цитокинов выявило достоверное увеличение содержания перфорин-позитивных CD8+лимфоцитов (при  раке молочной железы), TRAIL-позитивных CD8+лимфоцитов, увеличение клеток, продуцирующих IFNg (при немелкоклеточном раке легкого), что в сочетании с отсутствием стимуляции продукции ИЛ-4 и ИЛ-10 свидетельствует об преимущественно активации Тх1 иммуного клеточного ответа. При подборе различных модуляторов для усиления цитотоксической реакции, а именно провоспалительных цитокинов (ИЛ-12 и ИЛ-18), ингибиторов IDO (L-метил-1-триптофан) и COX-2 (целекоксиб) положительный эффект на цитотоксический противоопухолевый клеточный ответ достигнут при совместном применении ИЛ-12 и ИЛ-18.

Разработан план исследований клеточных препаратов, исследована противоопухолевая эффективность дендритно-клеточных вакцин в зависимости от протоколов лечении (профилактического и терапевтического). Показано, что, профилактическая схема лечения дендритно-клеточными вакцинами наиболее эффективна в отношении высокоагрессивных метастазирующих опухолей (карцинома легких Льюис, меланома В16), тогда как терапевтическая схема дендритно-клеточной вакцинации эффективна в отношении неметастазирующей опухоли (Кребс-2).

Проведен сравнительный анализ противоопухолевой активности антиген-специфических цитотоксических лимфоцитов  и общей фракции, активированных мононуклеарных клеток в тесте прямой цитотоксичности против клеточной линии рака молочной железы человека MCF-7. Показан достоверно более высокий уровень цитотоксического эффекта по разрушению опухолевых клеток в культуре эпитоп-специфических лимфоцитов после магнитной сепарации и культивирования с коктейлем цитокинов (ИЛ-15, ИЛ-7, ИЛ-2), по сравнению с культурой активированных мононуклеарных клеток и дендритных клеток.

 За время выполнения проекта опубликовано 7 статей в журналах, индексируемый в Scopus и/или Web of Science, и 2 статьи, в настоящее время, находятся на рассмотрении в редакциях журналов, индексируемых в Scopus и/или Web of Science. Подготовлены и отправлены на регистрацию в Роспатент 3 заявки на патент РФ на изобретение.

Практическая значимость исследования
Результаты работы могут быть применимы в области персонифицированной медицины в рамках специализированной медицинской помощи как индустриальным партнером (ЗАО «Компания Витамакс»), так и федеральными и региональными медицинскими центрами для широкого применения разработанных подходов клеточной иммунотерапии больных с раком молочной железы, колоректальный рак и немелкоклеточный рак легкого, а также других эпителиальных форм злокачественных новообразований. Помимо этого, результаты работы, возможно, применять для вторичной профилактики рецидива онкологического процесса и у пациентов с наследственной предрасположенностью развития эпителиальных форм опухолей. Использование разработанных протоколов для создания клеточных препаратов для профилактики онкологических заболеваний является важным конкурентным преимуществом по сравнению с современными иммунопрепаратами.