Регистрация / Вход
Прислать материал

14.579.21.0054

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.579.21.0054
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум"
Название доклада
Разработка аналитической тест-системы на основе анализа уровня микроРНК в плазме крови для малоинвазивной диагностики рака предстательной железы
Докладчик
Шкурников Максим Юрьевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
1) Создать аналитическую тест-систему на основе динамических биомаркеров для диагностики или типирования онкологических заболеваний.
2) Созданная аналитическая тест-система должна быть предназначена для диагностики рака предстательной железы и прогноза чувствительности к доцетакселу при гормонорезистентном раке предстательной железы на основе определения уровня пула циркулирующих в плазме крови микроРНК методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.
3) Разработать программу для ЭВМ, позволяющую интерпретировать результаты работы аналитической тест-системы, в том числе позволять диагностировать рак предстательной железы и прогнозировать чувствительность опухоли к доцетакселу при гормонорезистентном раке предстательной железы.
Актуальность и новизна исследования
Рак предстательной железы (РПЖ) является вторым по частоте и пятым по смертности среди злокачественных новообразований у мужчин в мире. Одной из важных клинических проблем является вопрос дифференциальной диагностики простатита, доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ) и РПЖ. Простатит является наиболее часто диагностируемым урологическим заболеванием у мужчин до 50 лет и третьим – после 50 лет. ДГПЖ также является распространенным заболеванием, проявляющимся в увеличение размера предстательной железы, что может оказывать значительное влияние на здоровье больного и требовать хирургического лечения при невосприимчивости к лекарственной терапии. ДГПЖ может развиваться и в 25 лет, однако гистологическое подтверждение чаще всего обнаруживается в возрасте примерно 50 лет, когда частота развития заболевания достигает 50%. Ранняя дифференциальная диагностика ДГПЖ и РПЖ является очень важным моментом в плане улучшения исходов и выживаемости при РПЖ.
Текущая скрининговая диагностика РПЖ включает метод ректального пальцевого исследования с чувствительностью около 37%, определение ПСА, уровень которого повышен как при РПЖ, так и при ДГПЖ, делая дифференциальную диагностику относительно сложным процессом, особенно при значениях ПСА из «серой зоны». Еще одним способом диагностики РПЖ является трансректальная биопсия под контролем ультразвука, однако данная методика имеет ограничения, связанные с техникой получения образцов. Инвазивность процедуры ставит вопрос дифференциальной диагностики ДГПЖ и РПЖ для решения о необходимости проведения первичной биопсии. В свете вышесказанного становится актуальным поиск новых маркеров диагностики РПЖ, а также для оценки течения болезни.
Описание исследования

Экспериментальная разработка методики получения плазмы крови, позволяющей минимизировать выход нуклеиновых кислот из форменных элементов крови будет выполнена на основе одного из наборов реагентов для выделения малых некодирующих РНК: mirVana PARIS kit (Cat nuAM1556, Ambion, Life Technologies, Texas, USA, TRIzol-LS (Cat nu10296010, Ambion, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA ) или miRNeasy Serum/Plasma Kit (Cat nu.217184. Qiagen, Hilden, Germany).
Высокопроизводительный анализ миРНома будет осуществляться на платформе Scanner 3000 7G (Affymetrix, США) с помощью чипов высокой плотности для анализа миРНома (GeneChip miRNA 4.0 Array).
Методика оценки уровня микроРНК будет разработана на основе одного из из следующих вариантов: Looped RT primer и TaqMan probes; PolyA-tail и SYBR Green; PolyA-tail, LNA и SYBR Green.
В рамках доклинической валидации аналитической тест-системы предполагается широкое использование ксенографтных моделей рака предстательной железы (клеточные линии PC3, DU145), разработанных проф. Удо Шумахером.
В рамках разработки математической модели для аналитической тест системы будет использован способ повышения достоверности классификации за счет метода отбора транскриптов, позволяющего снизить количество транскриптов благодаря оптимизации совокупной информативности результирующего набора вместо использования ранжирования по индивидуальной информативности. Следует отметить, что при этом для настройки классификатора будет использован более мощный по сравнению с традиционно используемыми центроидами аппарат SVM (метод опорных векторов).
Возможности обеспечить выбор глобально наиболее информативной совокупности микроРНК методом полного перебора нет даже при использовании суперкомпьютерных технологий (общее число вариантов составляет не менее 260, а обычно значительно превышает 2100, при этом рассмотрение каждого из вариантов является отнюдь не атомарным действием), однако есть возможность ослабления эвристик, используемых при оптимизации, что позволит построить диагностические и предиктивные тест-системы, предоставляющие более достоверную информацию для диагностики и выбора терапии при раке предстательной железы.
Ключевыми отличиями предлогаемого нами метода от существующих аналогов являются оптимизация совокупной информативности набора транскриптов вместо использования транскриптов с наибольшей индивидуальной информативностью, а также ослабление эвристик / увеличении числа реализаций в методах типа Монте Карло, используемых при отборе набора транскриптов. Для построения эффективных алгоритмов построения тест-системы будут определены функционалы, формализующие понятие совокупной информативности набора транскриптов, предложены подходы к их оптимизации, а также проанализированы возможные методы машинного обучения, которые будут использоваться для построения классификаторов. Кроме этого, будет разработан аппарат для сопоставления эффективности (достоверности) тест-систем с общим назначением. Предполагается изучить возможность эффективного применения как различных модификаций так называемых жадных алгоритмов (в частности, возвратных жадных алгоритмов, а также жадных алгоритмов с неединичной глубиной шага), так и направленных на построение редких представлений (sparse representations) методов l1-минимизации. Спектр методов машинного обучения, который планируется рассмотреть, включает, помимо метода опорных векторов и логистической регрессии, методы кластерного анализа, решающих деревьев, а также некоторые генетичские подходы к оптимизации.

Результаты исследования

Подготовлен обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы в области научно-технической проблемы, исследуемой в рамках ПНИ. Экспериментально разработана методика получения плазмы крови, позволяющая минимизировать выход нуклеиновых кислот из форменных элементов крови. Осуществлен сбор венозной крови и сформирована коллекция плазмы крови 382 доноров. Проведён анализ некодирующих РНК в 382 образцах плазмы с помощью микрочипов GeneChip miRNA 4.0 (Affymetrix).

Выбраны пары праймеров для 20 микроРНК (hsa-miR-155-5p, hsa-miR-619-5p, hsa-miR-6777-5p, hsa-miR-6085, hsa-miR-6511b-5p, hsa-miR-6886-5p, hsa-miR-149-3p, hsa-miR-4787-5p, hsa-miR-8084, hsa-miR-4274, hsa-miR-6869-5p, hsa-miR-7110-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-375, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-297, hsa-miR-940).
 
Созданы ксенографтные модели рака предстательной железы с использованием иммунодефицитных мышей и клеточных линии РПЖ человека PC3, DU145 и ARCAP-M. Адаптирована к специфике ксенографтных моделей разработанная ранее методика получения плазмы крови. Осуществлен анализ микроРНК в образцах ткани ксенографтов и плазмы крови. Выполнена экспериментальная проверка клинической значимости выявленных микроРНК на ксенографтных моделях рака предстательной железы. Созданы ксенографтные модели РПЖ человека в мыши с инактивированным геном CHD1. Подавление гена CHD1 в ксенографтных моделях приводит к повышению массы опухоли и числа метастазов в легких, уменьшению метастазов в костном мозге, изменению в полногеномном транскриптоме транскрипции генов путей и процессов, лежащих в основе развития рака.

Обоснован выбор и разработан лабораторный регламент изготовления аналитической тест-системы. Изготовлено 100 экспериментальных образцов тест-системы. Экспериментальная проверка выявленных микроРНК на охарактеризованной коллекции биологических образцов подтвердила их клиническую значимость. Разработана рабочая программная документация и программа и методика испытаний ПО для ЭВМ. Проведены предварительные испытания программы для ЭВМ с последующей корректировкой рабочей програмной документации.

В ФГБУ "НМИРЦ" Минздрава России проведена независимая проверка технических и функциональных характеристик экспериментальных образцов тест-системы на охарактеризованной коллекции биологических образцов (гиперплазия ПЖ, РПЖ и метастатическая форма РПЖ). Тест-система адаптирована к производственной базе индустриального партнера (Лаборатория "БиоКлиникум"). Разработан проект бизнес-плана. Исследована роль микроРНК, направленных против CD46, в патогенезе рака предстательной железы на ксенографтных моделях РПЖ человека DU145.

В рамках реализации проекта впервые в мире осуществлено крупномасштабное исследование микроРНома плазмы крови пациентов с раком предстательной железы, охватывающее весь спектр микроРНК mirBASE версии 21.

Практическая значимость исследования
В России заболеваемость РПЖ неуклонно возрастает. Так, в 2012 году зарегистрировано 27046 новых случаев РПЖ, показатель заболеваемости составил 40,2 на 100 000 мужчин. Среднегодовой прирост заболеваемости составил 9,83%, что соответствует первому месту по темпам прироста данного показателя.
Экономическое бремя болезни в 2009 г. составило 3 674 032 748 рублей и продолжает увеличиваться. Более половины расходов (65,35%) связано с впервые выявленными в отчетном году случаями заболевания. Основную часть экономического бремени РПЖ в РФ (73,13%) составляют прямые медицинские затраты, меньшая доля приходится на прямые немедицинские затраты (19,70%) и косвенные потери государства (7,17%).
Разработка и внедрение в клиническую практику набора реагентов позволит снизить стоимость скрининговых обследований и оптимизировать расходы на лечение.