Регистрация / Вход
Прислать материал

14.575.21.0064

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.575.21.0064
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет"
Название доклада
Разработка молекулярных сигнатур аутоантител к аддуктам ДНК для ранней диагностики рака легкого
Докладчик
Кжышковска Юлия Георгиевна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель исследования: Внедрение новых методов диагностики в сферу оказания специализированной медицинской помощи для увеличения результативности лечения и снижения смертности от онкологических заболеваний.
Задачи исследования:
- Идентификация методами масс-спектрометрии аддуктов циркулирующей ДНК в образцах клинического материала;
- Разработка мультиплексного анализа аутоантител к аддуктам циркулирующей ДНК;
- Разработка мультиплексного теста для исследования аутоантител к аддуктам ДНК в сыворотке больных с опухолями легкого.
Актуальность и новизна исследования
Онкологические заболевания являются одной их основных причин смертности на планете, составляя более 25% случаев всех смертей в развитых странах. Рак легкого (РЛ) занимает лидирующие позиции по заболеваемости и в структуре общей летальности от онкологических заболеваний у мужчин в мире и РФ, составляет 12,8 % в структуре онкологической заболеваемости населения мира, и диагностируется, как правило, на поздних стадиях процесса. Первичная диагностика и скрининг проводится с помощью компьютерной томографии, к недостаткам которой относится дороговизна и недоступность, а также недостаточно высокая чувствительность и специфичность. Ошибки диагностики при обращении больных наблюдаются почти у четверти больных, они приводят к задержке начала лечения от 3 месяцев до года. Использование новых методов ПЭТ, аутофлюоресцентной бронхоскопии для диагностики РЛ не привело к снижению смертности – из-за низкой эффективности именно ранней диагностики. Использование молекулярных циркулирующих опухолеассоциированных маркеров в сочетании с методами инструментальной визуализации – одно из перспективных направлений для повышения эффективности ранней диагностики РЛ. Основная идея исследования в установлении списка специфических аддуктов ДНК, комбинация, которых будет обладать диагностической значимостью для ранней диагностики рака легкого.
Описание исследования

Для решения поставленных задач на основе подходов доказательной медицины применен дизайн исследования «случай-контроль», где сформированы две группы добровольцев: группа со злокачественными опухолями легкого и контрольная группа здоровых добровольцев. Связь признака и болезни изучалась путем сравнения больных и не больных по частоте встречаемости среди них признака или, если признаки количественные, по уровню признака в каждой группе. Для идентификации аддуктов ДНК применены методы масс-спектрометрии. На сегодняшний день это самый чувствительный метод, который находит широкое применение в омикс-исследованиях. В разработке методики пробоподготовки применялись стандартные подходы к анализу ДНК методами масс-спектрометрии. Далее статистическими методами (метод главных компонент (PCA), методы кластеризации) определены онкозависимые аддукты ДНК. Анализ аутоантител к аддуктам циркулирующей ДНК произведен мультиплексным методом с использованием технологии Digiplex. В основе данной технологии лежат микрочастицы с нанесенным баркодом, конъюгированные с молекулами ДНК, прибор для считывания сигнала и программного средства для анализа полученных данных. Данная технология позволяет исследовать в одной пробирке до 128 различных маркеров с высокой степенью точности. Для создания теста синтезированы ДНК олигонуклеотиды с аддуктами. Полученные ДНК олигонуклеотиды ковалентно связаны с баркодированными микрочастицами. Полученные микрочастицы инкубированы с сывороткой больных раком легкого. После связывания аутоантител с микрочастицами последние отмываются от сыворотки и инкубируются с антителами, меченными флуоресцентным красителем (фикоэритрином), к человеческим иммуноглобулинам. Считывание интенсивности флуоресценции микрочастицы позволяет количественно определить концентрацию аутоантител в сыворотке пациента, а считывание баркода позволяет определить аддукт ДНК, антитела к которому были обнаружены. В качестве положительного контроля и для построения калибровочной кривой используются мышиные антитела, полученные в результате иммунизации мышей ДНК олигонуклеотидами с аддуктами.

 

 

Результаты исследования

В нашем исследовании показана связь изучаемых признаков – наличия (количественного уровня) аддуктов ДНК и наличия (количественного уровня) аутоантител в циркулирующей крови с раком легкого (РЛ). В настоящее время существует несколько разновидностей ассоциированных с опухолями маркеров: геномные, транскриптомные, протеомные, эпигенетические, метаболомные, микроРНК, все они могут детектироваться в крови. Сейчас большинство из них находится на той или иной стадии научных исследований, некоторые – на стадии валидации их клинической эффективности. Следует отметить, что анализ экспрессионных маркеров используется только для прогноза клинического течения заболевания и выбора тактики лечения, но неэффективен для ранней диагностики. В последние годы во всем мире интенсивно развивается направление выявления маркеров, так или иначе связанных с ДНК опухолевых клеток. К этим маркерам относятся опухоле-специфичные мутации, метилированные фрагменты ДНК и аддукты ДНК. Наличие патогенетически значимых для опухоли изменений ДНК в циркулирующих ДНК крови идентифицируют и количественно определяют методами масс-спектрометрии (TOF/TOF, TOF/MS, реже MS/MS). Аддукты ДНК являются весьма перспективным направлением исследований и разработок, так как их химическая структура значительно отличается от мутированной или метилированной ДНК, поэтому методами MS легко провести скрининг для выявления и дальнейшей идентификации аддуктов ДНК. Наиболее хорошо описаны аддукты ДНК с канцерогенными веществами, в том числе аддукты ПАУ-ДНК, бензпирен-ДНК, афлатоксин-ДНК, аминобифенил-ДНК и др. Бензпирен (BP) является высококанцерогенным полициклическим ароматическим углеводородом (PAH), присутствующим в выбросах выхлопных газов, приготовленной на угле пище и в небольшом количестве в сигаретном дыме. BP является одним из более 60 канцерогенов в сигаретном дыме, который включен в этиологию РЛ. Он метаболически активируется в бензпирен-7,8-диол-9,10-эпоксид (BPDE), который реагирует с ДНК преимущественно в N2-положении гуанина с образованием первоначально повреждений N2-гуанина, например аддукта бензпирен-7,8-диол-9,10-эпоксид-N2-деоксигуанозина (BPDE-dG). Также существует большое количество литературных данных, характеризующих аддукты ДНК, образующихся в результате действия повышенных концентраций активных форм кислорода (АФК) и химиотерапевтических препаратов, обусловливающих их действие. Однако достаточно сложно представить себе масс-спектрометрию в качестве рутинного метода анализа средней клинико-диагностической лаборатории. Так как все аддукты ДНК иммуногенны, при достижении некоторых пороговых концентраций они приводят к появлению аутоантител. Предлагаемый подход, основанный на поиске аутоантител к аддуктам ДНК является инновационным и весьма перспективным, поскольку отражает не экспрессию конкретного опухолевого маркера, а функциональное состояние опухолевых клеток – недостаточно эффективно функционирующую систему репарации,  характерное для различных нозологий. Как и в случае других циркулирующих маркеров опухолей, целесообразно одновременно анализировать набор аутоантител к аддуктам ДНК, вследствие этого мы выбираем иммуноферментный анализ, с помощью которого можно будет проводить одновременный анализ большого количества аутоантител. В рамках проведенных работ изготовлен экспериментальный образец макета тест-системы мультиплексного анализа для ранней диагностики РЛ.

Практическая значимость исследования
С практической точки зрения, данное исследование представляет собой попытку заложить основу для разработки нового метода ранней диагностики рака легкого, так как на сегодняшний день даже использование новых методов, таких как ПЭТ, аутофлюоресцентная бронхоскопия имеют низкую диагностическую значимость на ранних стадиях заболевания. Реализация проекта позволит создать принципиально новые селективные и чувствительные тест-системы для ранней диагностики рака легкого, обеспечивающие чувствительность не менее 90% и специфичность не менее 75 %. Социально-экономический эффект достигается за счет внедрения в практическое здравоохранение тест-систем, обеспечивающих достоверную раннюю диагностику социально-значимого заболевания – рака легкого. Диагностика указанного заболевания на ранней стадии позволит:
– снизить смертность населения от злокачественных новообразований, в том числе в течение года с момента взятия на учет;
– увеличить показатели раннего выявления злокачественных новообразований, оптимизировать и стандартизировать систему оказания медико-социальной помощи онкологическим больным;
– увеличить показатели выживаемости и улучшения качества жизни больных со снижением инвалидности.
Конечными потребителями результатов настоящего проекта – тест-систем для диагностики рака легкого, являются диагностические лаборатории (Инвитро, KDL и др.) – более 20 тысяч организаций в РФ, медицинские центры онкологической направленности (ФГБУ "НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова, НИИ Онкологии СО РАМН и т.д., лечебно-профилактические учреждения, имеющие в своем составе онокологичские отделения (более 2000 организаций в России)
Постер

Poster.ppt