Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0129

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0129
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича"
Название доклада
Разработка тест-системы для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека in vitro
Докладчик
Лисица Андрей Валерьевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цели выполнения ПНИ(ЭР):
1 Разработать отечественную тест-систему на основе кератиноцитов человека для обеспечения практической реализации утвержденных в РФ методов испытаний по воздействию химической продукции на организм человека на модели человеческой кожи in vitro (ГОСТ 32634-2014), получения достоверной информации о возможном риске воздействия химической продукции на организм человека, сокращения количества лабораторных животных, используемых при испытаниях химической продукции, гармонизации национальной и международной нормативно-правовой базы в части обращения, сертификации и оценки безопасности химической продукции.
2 Разработать (с учётом требований ГОСТ 32419-2013) новый методический подход определения класса опасности химической продукции, вызывающей поражение (некроз)/раздражение кожи in vitro с использованием разработанной тест-системы.

В 2016 году необходимо обеспечить экспериментальную разработку тест- системы. Для этого за счет средств субсидии требовалось решить следующие задачи:
- провести экспериментальное обоснование выбора базовой клеточной линии (базовых клеточных линий) (БКЛ);
- разработать протокол получения клеточного компонента тест- системы (ККТС) на основе БКЛ;
- наработать экспериментальные образцы ККТС на основе БКЛ; провести их испытания на соответствие требованиям ТЗ;
- экспериментально обосновать выбор контрольных веществ тест-системы с использованием ККТС на основе БКЛ;
- разработать технические требования к тест- системе (ТС), Программу и методики испытаний ТС;
- наработать экспериментальные образцы ТС, провести их испытания в соответствии с Программой и методиками испытаний, выполнить корректировку ТС.
Актуальность и новизна исследования
По данным ВОЗ объемы производства и использования химической продукции в мире постоянно возрастают, что повышает опасность, связанную с её вредным воздействием на здоровье человека. РФ – крупнейший мировой производитель и потребитель такой продукции. Требования российского законодательства в области безопасного обращения химической продукции постоянно усложняются и модифицируются, в том числе, с целью их гармонизации с международными нормативно-правовыми актами, регулирующими данную сферу деятельности.
В настоящее время все используемые на территории РФ химические вещества должны проходить процедуру токсикологических исследований, соответствовать ряду санитарно-гигиенических требований, требованиям безопасности и иметь подтверждение соответствия им. В обязательном порядке должна быть оценена их опасность для здоровья человека. Практически в РФ с этой целью используются данные экспериментальных исследований, объектом которых являются лабораторные животные. Вместе с тем ответ различных организмов на токсическое воздействие характеризуется видовой специфичностью. В этой связи в мире все активнее развиваются методики оценки видоспецифичной для человека токсичности химических соединений и их смесей в исследованиях in vitro с использованием в качестве объекта клеток человека.
Описание исследования

    Так, Организацией экономического сотрудничества и развития (ОЭСР, Organisation for Economic Cooperation and Development, OECD) разработаны и внедрены в практику испытаний химической продукции валидированные тесты для оценки коррозирующего и раздражающего действия химических веществ и их смесей на кожу человека, а также абсорбции химических веществ кожей  с использованием реконструированного эпителия человека (клеточная модель кожи) на основе нормальных кератиноцитов человека.

    В Российской Федерации также утверждены ГОСТ 32634-2014 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Разъедание/коррозия кожи: испытание на модели человеческой кожи in vitro» (Дата введения в действие: 01.06.2015) и ГОСТ 32435-2013 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Кожно-резорбтивное действие: метод in vitro» (Дата введения в действие: 01.08.2014). Однако их реальное внедрение в практику испытаний химической продукции затруднено в связи с отсутствием на рынке РФ объекта для экспериментальных исследований – специализированных клеточных тест-систем.

    В рамках настоящего ПНИЭР разрабатывается отечественный биотехнологический продукт - тест-система на основе кератиноцитов человека, пригодная для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека, что позволит обеспечить проведение в РФ токсикологических исследований и испытаний альтернативными методами (in vitro).
    Технология получения тест-системы базируется на применении собственного клеточного банка (исходное сырье) и оригинальных протоколов производства  клеточного компонента тест-системы, что позволяет получить инновационный продукт с  качественными характеристиками, не уступающими импортным аналогам, но с более низкой стоимостью. 

Клеточный компонент разрабатываемой тест–системы (ККТС) определяет основные технические характеристики и функциональные свойства разрабатываемой тест-системы. Он представляет собой клеточную модель кожи человека: многослойный плоский ороговевающий эпителий с роговым слоем, препятствующим проникновению цитотоксических веществ.

Для его получения используется создаваемый за счет средств индустриального партнера Банк биологических образцов - эксплантов кожи, полученных от доноров прижизненно, сформированный с соблюдением законодательства РФ на основании разработанного Регламента сбора, хранения и транспортировки биологических образцов. Донорами эксплантов кожи являются лица, удовлетворяющие требованию нормативных документов о донорстве и прошедшие необходимый медицинский осмотр. Из биологических образцов получены первичные культуры кератиноцитов человека.

ККТС получают на основании разработанного в рамках ПНИ(ЭР) протокола, позволяющего получать образцы с необходимыми, согласно ТЗ, техническими характеристиками. Для характеристики структуры ККТС (оценки соотношения пролиферирующих и дифференцированных клеток) используется метод флуоресцентной микроскопии (окраска на цитокератины). Стандартизация ККТС достигается в результате разработки Протокола ее получения, использования бессывороточной питательной среды для культивирования клеток.  На основе ККТС получены экспериментальные образцы ТС для оценки безопасности химической продукции в отношении здоровья человека in vitro. Диапазон информативности ТС установлен с учетом воспроизводимости изменений количественных параметров, характеризующих изменение функционального статуса клеток в составе ТС, в ответ на воздействие различных концентраций контрольного вещества.

В 2017 году  будет  экспериментально обоснована возможность использования разработанной ТС в качестве объекта испытаний при исследованиях в соответствии с утвержденными в РФ методами испытаний по воздействию химической продукции на организм человека на модели человеческой кожи in vitro (ГОСТ 32634-2014 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Разъедание/коррозия кожи: испытание на модели человеческой кожи in vitro»).

Результаты исследования

Основные результаты ПНИ (ЭР) в 2016 году:

-разработан протокол получения ККТС на основе базовых клеточных линий,

-наработаны экспериментальные образцы ККТС, проведены их испытания на соответствие требованиям ТЗ;

-разработана программа и методики испытаний ТС

-наработаны экспериментальные образцы, проведены их испытания, установлено соответствие техническим требованиям.

Из средств индустриального партнера сформирован Банк первичных клеточных культур (нормальных кератиноцитов человека), проводится его пополнение.

Технические характеристики разрабатываемой в рамках ПНИ (ЭР) ТС не уступают таковым у основных конкурентных продуктов (рекомендованы ОЕСД для использования в качестве объектов испытаний химической продукции в альтернативных тестах in vitro):

- тест- система EpiSkinTM,

- тест-система EpiDermTM (EPI-200),

- тест- система SkinEthicTM RHE.

Практическая значимость исследования
Основная область применения ожидаемых результатов – сертификационные испытания безопасности химической продукции в отношении здоровья человека. Разрабатываемая ТС предназначена для использования в качестве объекта испытаний при проведении исследований в соответствии с ГОСТ 32634-2014 «Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. Разъедание/коррозия кожи: испытание на модели человеческой кожи in vitro».
Другие возможные сферы применения разрабатываемой тест-системы:
1) сертификационные испытания безопасности косметической продукции;
2) доклинические исследования безопасности лекарственных средств, предназначенных для наружного применения;
3) экологический мониторинг;
4) санитарно-гигиеническое нормирование и обоснование безопасных уровней содержания химических веществ и их смесей;
5) технолого-биологический контроль качества природоохранных мероприятий и процессов очистки выбросов в окружающую среду.
Внедрение в практику сертификационных испытаний химической продукции разрабатываемых методических рекомендации по определению класса опасности химической продукции, вызывающей поражение (некроз)/раздражение кожи, с использованием разработанной тест-системы, повысит информативность сертификационных испытаний (за счет получения возможности оценивать видоспецифические для человека риски воздействия химической продукции на организм), сократит их продолжительность, снизит себестоимость, позволит уменьшить количество лабораторных животных, используемых в тестах in vivo, что будет способствовать гармонизации национальной и международной нормативно-правовой базы в области безопасного обращения химической продукции. После завершения проекта Консорциум Исполнителей планирует инициировать процедуру экспертной оценки информативности разработанных методических рекомендаций с целью решения вопроса о придании ей статуса нормативной национальной методики.