Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0063

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0063
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук
Название доклада
Создание адресных бифункциональных агентов на основе цитотоксического белка лактаптина и опухоль-адресованных пептидов для направленной элиминации раковых клеток.
Докладчик
Рихтер Владимир Александрович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель исследования: Разработка и получение адресных бифункциональных агентов с терапевтическим потенциалом - рекомбинантных слитых белков, состоящих из апоптоз-индуцирующего белка лактаптина и опухоль-адресованных пептидов, для направленной элиминации раковых клеток.

Задачи исследования:
1. Разработать технологический процесс получения рекомбинантных слитых белков «адресный пептид-лактаптин», обладающих цитотоксической и противоопухолевой активностью и состоящих из апоптоз-индуцирующего белка лактаптина и опухоль-адресованных пептидов.
2. Провести испытания цитотоксической активности слитых белков «адресный пептид-лактаптин» на культурах клеток мыши и человека in vitro.
3. Провести испытания адресных свойств полученных слитых белков «адресный пептид-лактаптин» на лабораторных животных с трансплантированными опухолями.
4. Провести испытания противоопухолевой активности полученных слитых белков «адресный пептид-лактаптин» на моделях алло- и ксенотрансплантатов in vivo.
5. Провести испытания острой токсичности слитых белков «адресный пептид-лактаптин» с наибольшим терапевтическим потенциалом на лабораторных животных
Актуальность и новизна исследования
При разработке современных противораковых лекарственных средств используют два подхода: избирательное воздействие на клеточные процессы и пути, отличающиеся у раковых и нормальных клеток, и адресную доставку цитотоксических средств в опухоль. Разработка средств таргетной терапии возможна благодаря множественным генетическим и эпигенетическим изменениям, происходящим при онкотрансформации и приводящим к изменениям протеомного профиля раковой клетки (Barollo S., 2016; Inoue, K., 2016). Этот поверхностный профиль является молекулярным адресом для доставки биомолекул с помощью адресующих лигандов (Brown, K. C., 2010). В качестве таких лигандов могут выступать короткие опухоль-адресующие пептиды, полученные скринингом фаговых пептидных библиотек.
Нарушение регуляции такого ключевого процесса жизнедеятельности клетки, как апоптоз, является одной из причин развития в организме злокачественных новообразований. Поэтому в настоящее время индукторы и модуляторы апоптоза раковых клеток рассматривают в качестве потенциальных онкотерапевтических средств (Millimouno F.M., 2014).
Таким образом, создание опухоль-адресованных противоопухолевых препаратов на основе природных белков и пептидов, способных вызывать апоптотическую гибель раковых клеток и не повреждающих здоровые клетки организма, является одним их активно развивающихся и очень актуальных направлений поиска новых противораковых лекарственных средств.
Настоящий проект направлен на создание противоопухолевого лекарственного средства, состоящего из апоптоз-индуцирующего белка лактаптина (фрагмента каппа-казеина молока человека) и опухоль-адресованного пептида, обеспечивающего доставку лактаптина в опухоль.


Описание исследования

При проведении работ по проекту созданы адресные бифункциональные агенты белковой природы с противоопухолевой активностью - рекомбинантные слитые белки, состоящие из апоптоз-индуцирующего белка лактаптина и опухоль-адресующих пептидов, обеспечивающих доставку лактаптина в опухоль.

            Опухоль-адресующие пептиды отобраны из фаговой пептидной библиотеки (Ph.D. Phage Display Library, New England BioLabs), созданной на основе нитчатого фага М13). Отбор производили методом фагового дисплея на культурах раковых клеток мыши и человека in vitro и на опухолевых моделях алло- и ксенографтов in vivo.

            Были определены последовательности отобранных пептидов и созданы генетические конструкции, обеспечивающие продукцию рекомбинантных слитых белков «адресный пептид-лактаптин». Генетические конструкции получены на основе вектора Pet15b. Ген слитого белка «адресный пептид-лактаптин» сконструирован таким образом, что при синтезе белка последовательность опухоль-адресованного пептида находится на N-конце белка «адресный пептид-лактаптин». Для выделения слитых белков «адресный пептид-лактаптин» из биомассы клеток-продуцентов в С-конец слитых белков введен полигистидиновый тракт (последовательно расположенные 6 остатков гистидина). Подтверждение правильной структуры плазмидных ДНК проводили методом рестрикционного анализа и секвенирования районов вставок.

            Рекомбинантные штаммы E. coli, обеспечивающие наработку слитых белков «адресный пептид-лактаптин», получены на основе реципиентного штамма E. coli BL21(DE3) методом временной доминантной селекции с использованием в качестве маркера гена устойчивости к ампицилину. Подтверждение наработки слитых белков клетками-продуцентами осуществляли методом электрофореза в ПААГ.

               Препаративную наработка рекомбинантных слитых белков осуществляли на технологичной культуре рекомбинантного штамма E. coli BL21(DE3), трансфомированного генетическими конструкциями, несущими гены, кодирующие целевые слитые белки «адресный пептид-лактаптин».

            Очистку целевых белков проводили серией последовательных ионообменных хроматографий. Оценку чистоты и подлинности рекомбинантных слитых белков осуществляли методом электрофореза в ПААГ, Вестер-блот анализом, ВЭЖХ и MALDI TOF масс-спектрофотометрией. Для оценки содержания бактериальных эндотоксинов использовали ЛАЛ-тест.

            Разработанный технологический процесс позволяет получать целевые продукты минуя стадии наработки, выделения и очистки каждого компонента (лактаптина и адресного пептида) в отдельности, а также стадию финальной конъюгацию двух белковых молекул.

            Оценку цитотоксической активности рекомбинантных слитых белков на культурах раковых клеток мыши и человека проводили путем определения 50%-ной цитотоксической дозы (ИК50) с использованием реагента МТТ (3,4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолиум бромид).

            Накопление рекомбинантных слитых белков в опухолевой ткани оценивали на опухолевых моделях гепатокарциномы мыши ГА-1 и аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231. Мышам с подкожно трансплантированной опухолью внутривенно (в хвостовую вену) вводили конъюгаты слитых белков с флуоресцентным красителем Cy5. Опухоли извлекали, интенсивность флуоресценции исследуемых опухолей измеряли на приборе KODAK In Vivo FX Professional Imaging System

            Противоопухолевую эффективность рекомбинантных слитых белков оценивали по торможению роста подкожно трансплантированных опухолей мыши (ГА-1) и человека (MDA-MB-231).

            Испытания острой токсичности слитых белков «адресный пептид-лактаптин» с наибольшим терапевтическим потенциалом проводили на мышах и крысах согласно рекомендациям «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств».

 

Результаты исследования

Разработана методика отбора опухоль-адресующих пептидов в системах in vitro и in vivo. На культурах раковых клеток гепатокарциномы А1 (ГА-1) и аденокарцинома легкого (АЛ) мыши и на мышиной опухолевой модели ГA-1 отобраны фаговые клоны, несущие пептиды GLHTSATNLYLH (Т1) и SGVYKVAYDWQH (Т2). В системе in vitro на клетках аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и MDA-MB-231 и аденокарциномы легкого А549 отобраны пептиды YTYDPWLIFPAN (Т3) и FIPFDPMSMRWE (Т4). Показано специфическое накопление бактериофагов, экспонирующих пептид Т3, в опухолевой ткани MDA-MB-231.

            Получены рекомбинантные плазмиды, кодирующие слитые белки, состоящие из отобранных пептидов и лактаптина, а также из опухоль-адресующего iRGD-пептида и лактаптина. Получены рекомбинантные штаммы E.сoli, продуцирующие целевые слитые белки.

            Разработана методика получения рекомбинантных слитых белков и проведена наработка экспериментальных образцов слитых белков.

            Разработана Программа и методики испытаний экспериментальных образцов слитых белков и методика оценки количественных параметров, характеризующих специфическую активность слитых белков.

            Разработан План исследований специфической активности рекомбинантных слитых белков. Наибольшую цитотоксическую активность в отношении всех линий раковых клеток человека показал слитый белок Т3_RL. Наибольшую тропность к опухолевой ткани продемонстрировали белки T1_RL - для опухоли мыши и T3_RL - для опухоли человека. Наибольшей противоопухолевой активностью в отношении опухоли ГА-1 обладает белок RL_H_RGD (ТРО = 59,8%). При терапии опухоли человека MDA-MB-231 наибольшую эффективность показал белок Т3_RL (ТРО = 79,2%). Слитым белком с наибольшим терапевтическим потенциалом является рекомбинантный белок T3_RL.

            Разработан Лабораторный технологический регламент получения слитого белка T3_RL, как белка с наибольшим терапевтическим потенциалом. Проведена оценка острой токсичности T3_RL на мышах и крысах согласно рекомендациям «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств». Проведены исследовательские испытания экспериментальных образцов T3_RL по ПМ испытаний.

            Разработаны Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации продукции и проект ТЗ на ОТР.

            Получен патент РФ № 2595404 от 03.08.2016 «Опухоль-специфический пептид для адресной химиотерапии опухолей молочной железы человека».

            Поданы заявки на изобретения № 2016109518 от 16.03.2016 и № 2016120496 от 25.05.2016.

            Результаты, полученные при выполнении проекта, соответствуют мировому уровню исследований, поскольку как использование терапевтических белков, способных избирательно уничтожать опухолевые клетки, не оказывая токсического воздействия на нормальные ткани и органы, так и применения опухоль-адресующих пептидов для диагностики и таргетного лечения злокачественных новообразований являются перспективными и стремительно развивающимися направлениями биоотерапии онкологических заболеваний (Brown, K. C., 2010; Babickova, J., 2013; He, X. Q., 2015; Diaz-Perlas, C., 2016; Ruoslahti, E.,2016; Benavent, F., 2016)

Практическая значимость исследования
Полученные в результате выполнения проекта научно-технические результаты могут быть использованы в фундаментальных и прикладных исследования, а также при производстве лекарственных средств и в практическом здравоохранении.
Результаты проекта будут востребованы исследовательскими организациями, биотехнологическими компаниями, разрабатывающими новые противоопухолевые препараты, фармацевтическими компаниями, которые занимаются производством противоопухолевых терапевтических средств, и организациями практического здравоохранения для терапии злокачественных новообразований и улучшения качества жизни онкологических больных.
Результаты проекта будут востребованы международным научным сообществом, в том числе при представлении на международных конференциях, и могут являться основой для международных фундаментальных исследований и прикладных проектов.