Регистрация / Вход
Прислать материал

14.613.21.0006

Аннотация скачать
Общие сведения
Номер
14.613.21.0006
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Название доклада
Метод персонифицированной генодиагностики атеросклероза и оценка его эффективности в репликативных межпопуляционных исследованиях
Докладчик
Собенин Игорь Александрович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Проект направлен на изучение генетической предрасположенности к развитию атеросклероза, обусловленной мутациями митохондриального генома. Задачами исследования являются разработка метода персонифицированной генодиагностики атеросклероза на основе измерения суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома путем определения степени гетероплазмии по ряду мутаций митохондриальной ДНК – генетических маркеров атеросклероза; разработка лабораторного образца диагностического набора для определения степени гетероплазмии по мутациям митохондриальной ДНК в составе метода персонифицированной генодиагностики атеросклероза; проведение репликативных исследований для оценки эффективности метода персонифицированной генодиагностики атеросклероза.
Актуальность и новизна исследования
Предлагаемый подход к диагностике предрасположенности к атеросклерозу позволит определить новые виды и сочетания биомаркеров, которые, наряду с традиционными факторами риска, помогут идентифицировать пациентов, имеющих высокий риск развития атеросклеротических заболеваний и провести своевременные профилактические мероприятия. Ранняя эффективная профилактика атеросклеротических заболеваний приведет к снижению заболеваемости и сердечно-сосудистойсмертности. Метод персонифицированной генодиагностики атеросклероза даёт возможность получить количественные характеристики, по точности превышающие другие способы оценки генетического риска, применяемые в мировой науке.
Описание исследования

Ключевой задачей проекта является разработка и создание метода персонифицированной генодиагностики атеросклероза, а основной научно-технической задачей - разработка диагностического набора для определения степени гетероплазмии по мутациям митохондриальной ДНК с целью использования в составе диагностического метода. Такой диагностический набор будет использован в диагностике генетической предрасположенности к атеросклерозу путем измерения суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома. В основе диагностики лежит определение степени гетероплазмии по ряду мутаций митохондриальной ДНК – генетическим маркерам атеросклероза. Наиболее правильным научно-техническим решением проблемы является выявление наиболее значимых мутаций и их сочетаний и последующая разработка дешевых и доступных методов генодиагностики; приемлемыми технологическими подходами являются диагностикумы на основе ПЦР-РВ. В ходе выполнения проекта на ограниченной выборке идентифицированы точечные мутации митохондриального генома клеток крови человека – генетических маркеров предрасположенности к атеросклерозу - с использованием технологии полногеномного секвенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing, NGS), а также создан лабораторный образец диагностического набора в качестве научно-технического задела для дальнейших разработок. Для количественной диагностики атеросклероза использовано ультразвуковое сканирование бассейна сонных артерий в режиме высокого разрешения. Определена вариабельность митохондриального генома клеток крови, а также идентифицирован спектр точечных генома клеток крови, ассоциированных с атеросклерозом. В результате разработан перечень из 25 мутаций - кандидатов на включение в состав диагностического набора для определения генетической предрасположенности к атеросклерозу. Для этих мутаций разработаны праймеры и зонды для ПЦР-РВ, предназначенные для количественного определения степени гетероплазмии митохондриального генома клеток крови по мутациям, обладающим высокой диагностической значимостью в отношении индивидуальной предрасположенности к атеросклерозу. В результате получен лабораторный образец диагностического набора для измерения степени гетероплазмии митохондриальной ДНК методом ПЦР-РВ. Далее на расширенной выборке обследуемых лиц, включающей здоровых лиц без клинических признаков ишемической болезни сердца и больных ишемической болезнью сердца, в том числе, с перенесенным инфарктом миокарда, проведена оценка диагностических и технических характеристик разработанного диагностического набора в условиях кросс-секционного клинического исследования. Проведено генотипирование по анализируемым мутациям с использованием разработанного лабораторного образца диагностического набора на основе технологии ПЦР-РВ. По результатам кросс-секционного клинического исследования определены диагностически значимые мутации митохондриального генома, выполнена оценка диагностических характеристик лабораторного образца диагностического набора, а также определены технические характеристики диагностического набора, в том числе, условия и технические средства, обеспечивающие проведение измерений. На основании результатов оценки должен быть определен окончательный состав диагностического набора с ожидаемым количеством информативных генетических маркеров от 10 до 15.

Результаты исследования

На основании результатов анализа информационных источников было установлено, что использование показателя суммарной мутационной нагрузки митохондриального генома в качестве маркера атеросклероза и предрасположенности к развитию атеросклероза является оправданным. Были разработаны технические решения, которые заключаются в применении метода оценки митохондриальных мутаций на основе технологии мультиплексной ПЦР-РВ с использованием зондов типа TaqMan. Был определен способ расчета процента мутантного аллеля с использованием одной пары праймеров для амплификации фрагмента мтДНК, содержащего анализируемый сайт, двух зондов, различающиеся по способности гибридизации с диким или мутантным участком мтДНК, и синтетических контрольных последовательностей, воспроизводящих анализируемые фрагменты мтДНК для постановки контрольной пробы. Путем полногеномного секвенирования митохондриальной ДНК из клеток крови участников исследования был определен перечень из 25 вариантов (мутаций) мтДНК, ассоциированных с атеросклерозом. Был разработан персонифицированной генодиагностики атеросклероза и определены его диагностические характеристики. В качестве диагностических маркеров были определены мутации (варианты) митохондриального генома 652ins/delG, A750G, A1555G, C3256T, T3336C, С5178А, 8516insA/C/AC, 8528insA, 8930insG, G9477A, 10958insC, A12308G, G12372A, 13047insC, 13050insC, C14766T, G15059A, A15326G. Выбор маркеров был основан на результатах полногеномного секвенирования и уточнен на основании результатов генотипирования  мтДНК из крови 300 участников исследования. Чувствительность метода в оригинальном исследовании составила 81,1%, специфичность – 79,6%, точность диагностики – 80,3%. Была проведена апробация метода в репликационном исследовании, включающей 223 условно здоровых лиц без клинических проявлений атеросклероза и 227 больных ишемической болезнью сердца, в том числе, 82 больных ИБС, перенесших инфаркт миокарда. Установлено, что 4 мутации в репликационном исследовании (652ins/delG, A1555G, C3256T, C14766T) коррелировали с количественными характеристиками атеросклероза. При этом другие мутации, не будучи напрямую связанными с количественными характеристиками атеросклероза, коррелировали со значимыми мутациями, то есть могли являться модуляторами их патогенетического эффекта. Отмечалась также корреляция ряда мутаций между собой. Эти данные говорят в пользу сочетанного наследования мутаций, что подтверждается собственными данными о наличии в популяции проатерогенных и антиатерогенных гаплотипов митохондриального генома. Репликационная оценка диагностической эффективности метода персонифицированной генодиагностики атеросклероза дала следующие результаты: чувствительность в отношении атеросклероза (гемодинамически значимых бляшек) - 82,7%, специфичность – 79,3%, точность диагностики – 80,0%. Чувствительность в отношении ИБС составила 78,0%, специфичность – 76,7%, точность диагностики – 77,3%. Чувствительность в отношении инфаркта миокарда составила 87,9%, специфичность – 65,3%, точность диагностики – 69,3%. Таким образом, в ходе выполнения проекта выявлены ранее неизвестные варианты мтДНК и комбинации вариантов мтДНК, ассоциированные с атеросклерозом. Разработанный метод персонифицированной генодиагностики атеросклероза является оригинальным решением, ранее не использовавшимся в мировой науке.

Практическая значимость исследования
Областями применения полученных результатов или созданной на их основе инновационной продукции являются медицина, здравоохранение, профилактические программы. Результаты ПНИ могут быть использованы научно-исследовательскими учреждениями в сотрудничестве с производственными компаниями для проведения ПНИЭР, направленных на создание методик и технических средств для диагностики, профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, разработки геномных и постгеномных лекарственных средств для лечения сердечно-сосудистых заболеваний в сотрудничестве с производственными компаниями, создания технологий лечения бессимптомного атеросклероза. Использование метода ПЦР-диагностики генетической предрасположенности к ишемической болезни сердца и атеросклерозу будет способствовать более качественному определению индивидуального риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений и последующей разработке персонализированной стратегии профилактики.