Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0104

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0104
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Название доклада
Разработка прототипов препаратов для противоопухолевой терапии на основе антимикробных пептидов молекулярных факторов системы врожденного иммунитета
Докладчик
Овчинникова Татьяна Владимировна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Проект направлен на разработку новых препаратов для противоопухолевой терапии на основе антимикробных пептидов (АМП) с целью повышения эффективности методов химиотерапии при лечении социально значимых онкологических заболеваний. В качестве объектов исследования будут выбраны полипептиды, являющиеся представителями различных структурных семейств АМП, для которых установлено наличие противоопухолевой активности. Для получения лабораторных образцов исследуемых пептидов будут использованы технологии рекомбинантных ДНК. Получение высокопродуктивных штаммов позволит быстро и эффективно нарабатывать тестируемые полипептиды и масштабировать их производство. Очистка препаратов будет осуществляться с помощью металлохелатной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Будет проведено исследование цитотоксической активности препаратов в отношении культур опухолевых клеток в условиях in vitro, а также тестирование противоопухолевой активности in vivo на ксенографтах рака человека, трансплантированных мышам. Будет определен преобладающий механизм цитотоксического действия исследуемых веществ. Оценка безопасности прототипов препаратов будет выполнена путем определения гемолитической активности и цитотоксичности в отношении различных линий нормальных клеток млекопитающих, а также в ходе тестирования острой токсичности на мышах. По результатам оценки величины терапевтического индекса будет отобрано не менее двух перспективных прототипов для дальнейших исследований.
Актуальность и новизна исследования
Онкологические заболевания являются одной из основных причин человеческой смертности в современном мире. В 2012 г. более чем у 14,1 миллионов людей был диагностирован рак, 8,2 миллионов умерло от рака. По оценкам ВОЗ, при сохранении текущих тенденций к 2030 г. заболевания этой группы будут уносить ежегодно 13 миллионов человеческих жизней. Современные методы лечения – хирургия, химиотерапия, лучевая и гормональная терапия – не приводят к ремиссии более чем в половине случаев. Серьезную угрозу для тех, кто успешно прошел курс химиотерапии, представляют собой рецидивы опухолей. Существенными недостатками химиотерапевтического подхода являются развитие резистентности опухолевых клеток, а также токсичность многих препаратов для здоровых клеток. Среди кандидатов на роль противоопухолевых средств нового поколения рассматриваются белки и пептиды системы врожденного иммунитета человека и животных. На сегодняшний день известно около ста противоопухолевых АМП. Механизмы их цитотоксического действия мало изучены. Предполагается, что данный эффект может развиваться как по пути индукции апоптоза, так и за счет лизиса клеточных мембран и некроза пораженной ткани. В ряде работ в условиях in vitro была показана селективность действия катионных АМП по отношению к опухолевым клеткам. Открытие противоопухолевых свойств АМП, эффективности и селективности их цитотоксического действия позволяет рассматривать их в качестве прототипов для создания новых противоопухолевых препаратов. Особое внимание уделяется таким аспектам противоопухолевой активности АМП, как быстрота развития цитотоксического эффекта и низкая вероятность формирования лекарственной резистентности.
Описание исследования

В ходе экспрессии каждый из целевых пептидов получали в виде гибридного белка, содержащего октагистидиновую последовательность и модифицированный тиоредоксин. Клеточный осадок ресуспендировали в буфере А1, содержащем 6М гуанидин-НCl, в гомогенизаторе Даунса до получения однородной клеточной суспензии. Суспензию переносили в стакан и подвергали ультразвуковому лизису в течение 5 циклов, чередуя стадии обработки в течение 30 секунд со стадиями охлаждения во избежание перегрева суспензии. Растворенную фракцию рекомбинантного белка получали центрифугированием суммарного лизата при 4°С, 15000 об·мин–1 в течение 30 минут. Супернатант, содержащий рекомбинантный белок, аккуратно декантировали и наносили на колонку с металлохелатным носителем. Гибридный белок, содержащий октагистидиговую последовательность, подвергали очистке с помощью аффинной металлохелатной хроматографии на Ni-NTA агарозе в денатурирующих условиях. Расщепление гибридного белка проводили с помощью реакции с бромцианом в кислой среде. Финальную стадию очистки гибридного белка проводили методом обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ) в системе буферов, содержащих ацетонитрил и 0,1% ТФУ в тридистиллированной воде. Детекцию проводили на спектрофотометре при длине волны 214 нм.

Оценка цитотоксичности проводилась на опухолевых и нормальных клеточных линиях человека. Адгезионные клеточные линии культивировали на среде DMEM/F12 (1:1), суспензионные клеточные линии – на среде RPMI-1640 при 37°С и в присутствии 5% СО2. Обе среды содержали 10% ЭТС (Invitrogen, США). Адгезионные клетки в количестве 1×104 в 100 мкл среды DMEM/F12 помещались в ячейки 96-луночного планшета. Через 24 ч к клеткам добавляли раствор АМП. Были исследованы не менее шести различных концентраций биологически активных молекул. Суспензионные клетки в количестве 2×104 на лунку добавляли в первый день эксперимента непосредственно к растворам действующих веществ в серийных разведениях в среде RPMI-1640. Каждая концентрация действующих веществ была использована в трёх повторностях. Для определения цитотоксического эффекта через 48 ч после добавления каждого из действующих веществ проводился стандартный МТТ-тест. Статистическую обработку данных проводили при помощи программы GraphPad PRISM 6.0.

Для проведения гемолитического теста  к растворам АМП добавляли по 50 мкл 8% взвеси эритроцитов. После инкубации при интенсивном перемешивании в течение 1,5 ч при 37˚С планшеты центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об·мин–1. Оценку количества гемоглобина в растворе осуществляли по поглощению раствора при 405 нм. В качестве отрицательного контроля (K–) использовали супернатант, полученный после центрифугирования эритроцитов, инкубировавшихся в растворе PBS без добавления пептида. В качестве положительного контроля (K+) использовали супернатант, полученный после центрифугирования эритроцитов, инкубировавшихся в 0,1% водном растворе неионного детергента Triton X-100, вызывающего их полный лизис.

Процент гемолиза рассчитывался по формуле:

 (OD405 пробы – OD405 K–) х 100% / OD405 K+

Анализ механизма индукции клеточной гибели проводили с помощью двойного окрашивания аннексином V-ФИТЦ и иодидом пропидия.  Подсчёт мертвых клеток осуществляли методом проточной цитофлуориметрии спустя 48 ч после добавления действующих веществ при помощи набора реактивов AnnexinV-FITC Apoptosis Detection Kit I («BDPharmingen», США) согласно стандартному протоколу на приборе Beckman Coulter Cytomics FC50. Каждый эксперимент проводился в трёх повторностях.

Для оценки доли жизнеспособных клеток использовали маркер клеточной гибели – трипановый синий. Для приготовления 0,5% раствора 500 мг трипанового синего фирмы Merck (Германия) растворяли в 100 мл горячего (80-90°С) 0.9% раствора хлорида натрия. Раствор перемешивали 10 мин на магнитной мешалке и фильтровали. К суспензии клеток добавляли трипановый синий и подсчитывали в камере Горяева под микроскопом количество включивших краситель (погибших) и не включивших краситель (живых) клеток после их инкубации с пептидами в течение различных промежутков времени.

Для оценки морфологических изменений, происходящих в клетках после их обработки пептидами, приготавливали мазки. Клетки в концентрации 500 тыс./мл инкубировали с пептидами в течение различных промежутков времени. Затем клетки центрифугировали при 300 g в течение 10 мин, супернатант удаляли, а сконцентрированную клеточную суспензию наносили на предметное стекло. Последовательную окраску мазков проводили по стандартным методикам.

Результаты исследования

Впервые из лейкоцитов русского осетра Acipenser gueldenstaеdtii получен набор новых АМП, названных аципенсинами и представляющих собой фрагменты гистона Н2А. Осуществлена структурно-функциональная характеристика аципенсинов, выполнено гистохимическое выявление этих пептидов в лейкоцитах рыб. Рекомбинантные антимикробные пептиды аципенсин-1 и его укороченный аналог Ac(33) не обладают выраженной противоопухолевой активностью. Получен антимикробный пептид лейкоцитов русского осетра - аципенсин 1, конъюгированный с флуоресцентным красителем BODIPY FL. С помощью конфокальной микроскопии показано, что аципенсин, несущий флуоресцентную метку, проникает в опухолевые клетки (клетки эритромиелоидного лейкоза человека К-562) in vitro и детектируется в цитоплазме клеток. Полученные данные свидетельствуют в пользу возможности использования аципенсинов в качестве средств доставки лекарственных препаратов в опухолевые клетки.

Выделено два новых АМП – минибактенецины из лейкоцитов домашней козы Capra hircus – и проведена их структурно-функциональная характеристика. Анализ первичной структуры полученных пептидов, названных mini-ChBac7.5Nα, mini-ChBac7.5Nβ показал, что они являются N-концевыми фрагментами пептида ChBac7.5, который впервые выделен нами из лейкоцитов. Показано, что оба пептида не проявляют выраженной цитотоксической активности в отношении как опухолевых, так и нормальных клеток.

С помощью гетерологической экспрессии в клетках E.coli BL12(DE3) под контролем промотора бактериофага T7 получены рекомбинантные аналоги АМП ареницина из морского червя Arenicola marina, тахиплезина из мечехвоста Tachypleus tridentatus, гомезина из паука Acanthoscurria gomesiana, аципенсина из лейкоцитов осетра Acipenser gueldenstadtii. Оптимизированы условия их экспрессии и очистки перечисленных АМП. Изучение противоопухолевой активности исследуемых АМП показало, что тахиплезин I обладал наиболее высокой цитотоксичностью по отношению ко всем изученным опухолевым клеточным линиями (14,8 – 43,5 мкМ).

Получены аналоги бактенецина ChBac3.4, которые обладают повышенной по сравнению с исходным пептидом цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток. Показано, что цитотоксическая активность пептида ChBac3.4-1 в отношении нормальных клеток человека существенно не отличается от соответствующих показателей, полученных для исходного бактенецина, в то время как ChBac3.4-2 проявляет более выраженные токсические эффекты в отношении использованных нетрансформированных клеток.

Исследован механизм цитотоксического действия аналога бактенецина козы ChBac3.4-1 и тахиплезина I. Проанализированы морфологические изменения в клетках, обработанных пептидами, исследована динамика цитотоксического действия, проведено исследование характера клеточной гибели, обусловленной воздействием пептидов.

Показано, что наиболее перспективными прототипами с точки зрения эффективности и безопасности являются тахиплезин I и бактенецин ChBac3.4-1.

В целом, проведенные исследования представляют важную информацию для разработки новых противоопухолевых препаратов на основе антимикробных пептидов –молекулярных факторов системы врожденного иммунитета.

Практическая значимость исследования
Областью применения результатов ПНИ является фундаментальная и прикладная медицина и биотехнология. Изучение противоопухолевых свойств антимикробных пептидов позволит углубить понимание молекулярных основ функционирования системы врожденного иммунитета. Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых лекарственных средств, способных повысить эффективность существующих в настоящее время методов химиотерапии при лечении социально значимых онкологических заболеваний. Наряду с созданием монокомпонентных препаратов возможно использование исследуемых веществ в комбинации с уже известными цитостатиками. Внедрение в клиническую практику препаратов на основе природных антимикробных пептидов, обладающих широким спектром противоопухолевой активности и иммуномодулирующими свойствами и не вызывающих клинически значимого побочного эффекта, позволит повысить эффективность лечения онкологических заболеваний и снизить смертность онкологических больных. Изучение механизмов воздействия антимикробных пептидов на нормальные и опухолевые клетки человека позволит рационально конструировать и получать новые пептиды с заданными свойствами, такими как специфичность и механизм индуцируемой клеточной гибели. Создание противоопухолевых препаратов пептидной природы позволит уменьшить токсичность химиотерапии, вследствие этого улучшить выживаемость и качество жизни онкобольных. В ходе выполнения проекта получены результаты, на основании которых могут быть составлены рекомендации для разработки новых лекарственных средств на основе антимикробных пептидов, а также для изучения эффективности и безопасности в доклинических и клинических испытаниях. Возможные потребители ожидаемых результатов – научные и научно-производственные организации, занимающиеся разработкой, доклиническими и клиническими исследованиями новых лекарственных препаратов, биотехнологическим производством препаратов белково-пептидной природы.