Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0013

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0013
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.Г.К.Скрябина Российской академии наук
Название доклада
Получение препаратов рекомбинантных гидролитических ферментов для кормоподготовки и ветеринарии
Докладчик
Леонтьевский Алексей Аркадьевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель проекта: разработка новых ферментных препаратов для осахаривания кормов, а также для лечения и профилактики инфекционных заболеваний животных.

Задачи проекта:
- поиск генов, кодирующих гидролитические ферменты, в геномах микроорганизмов;
- получение рекомбинантных продуцентов и очистка гидролитических ферментов;
- изучение свойств гидролитических ферментов (удельная активность, субстратная специфичность, термостабильность, оптимальная
температура реакции) и отбор ферментов с лучшими свойствами;
- изучение структурных основ функционирования гидролитических ферментов;
- отработка технологических условий получения ферментных препаратов.

Актуальность и новизна исследования
Животноводство является одной из главных частей агропромышленного комплекса государства. В России за последние десять лет общее производство мяса выросло почти вдвое, а производство мяса птицы - более чем втрое. Наибольшие затраты при производстве мяса связаны приходятся на производство корма и на лечение и профилактику заболеваний животных. Использование ферментов снижает затраты на корма на 10 – 15%, что снижает себестоимость продукции. В связи с развитием животноводства в России происходит увеличение спроса на препараты для улучшения свойств кормов животных. Поэтому разработка новых ферментных препаратов на основе гидролаз с новыми свойствами является перспективной и соответствует требованиям рынка.
Инфекционные заболевания сельскохозяйственных животных, вызываемые бактериями, представляют большую проблему для сельского хозяйства. Болезни, вызываемые бактериями родов Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia, Pseudomonas, Bacillus, - мастит крупного рогатого скота, эндометрит, трофические раны, сибирская язва, сепсис приводят к гибели животных и снижают качество животноводческой продукции. Использование антибиотиков в животноводстве ограничено в силу высоких требований по их содержанию в сельхозпродукции, а также из-за увеличивающегося числа антибиотикоустойчивых штаммов. Одним из путей решения проблемы инфекционных заболеваний животных является разработка и внедрение в практику эффективных биологических антибактериальных препаратов на основе бактериолитических ферментов.
Описание исследования

В настоящее время происходит массовое секвенирование геномов микроорганизмов. В GeneBank уже опубликованы тысячи геномов различных организмов, в том числе бактерий. Многие из аннотированных генов кодируют гидролитические ферменты и практически не изучены. Всероссийская коллекция микроорганизмов является одной из крупнейших коллекций микроорганизмов в мире и является одним из подразделений исполнителя проекта - ИБФМ РАН. В коллекции депонированы десятки видов бактерий, для которых опубликованы геномы. Это открывает возможность получения новых ферментных препаратов для сельского хозяйства, обладающих новыми свойствами. В ходе выполнения работы было запланировано получение новых ферментных препаратов на основе рекомбинантных гидролаз, полученных с помощью единого технологического подхода. Технологический подход состоит из следующих стадий: поиск генов гидролаз среди геномов тех видов бактерий, штаммы которых депонированы в ВКМ; клонирование отобранных генов и получение рекомбинантных гидролаз; изучение свойств рекомбинантных гидролаз и отбор гидролаз с наиболее полезными с практической точки зрения свойствами; разработка ферментных препаратов на основе отобранных ферментов; разработка технологических регламентов производства отобранных ферментов. Объектами исследований являются два вида гидролаз. Во-первых, гидролазы, разрушающие углеводные полимеры сельскохозяйственного сырья, улучшая его питательные свойства (гемицелюлазы, бета-глюкозидазы, целлюлазы, бета-глюконазы и др.), во-вторых, гидролазы, разрушающие клеточные стенки бактерий (литические протеазы).

Результаты исследования

К настоящему времени проведён отбор генов, кодирующих осахаривающие и бактериолитические гидролазы, у бактерий с опубликованными геномами, которые депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ). В геномах отобранных штаммов обнаружено 277 генов, кодирующих осахаривающие и батериолитические гидролазы. Клонировано 103 гена. Выполнено
секвенирование генома бактерии Lysobacter sp. XL1, которая продуцирует комплекс бактериолитических гидролаз. Проведено
аннотирование генома. Идентифицировано пять генов, кодирующих бактериолитические гидролазы. Проведено исследование рынков осахаривающих и бактериолитических препаратов. Созданы проекты бизнес-планов производства и продажи препаратов на основе осахаривающих и бактериолитических гидролаз. Были написаны праймеры для клонирования генов гидролаз в экспрессионный вектор. Получено 31 рекомбинантный штамм на основе E. coli, 9 рекомбинантных штаммов на основе Kluyveromyces lactis, 58 рекомбинантных штаммов на основе Pichia pastoris. Обнаружено, что гидролазы эффективно экспрессируются в рекомбинантных продуцентах на основе E. coli и Pichia pastoris, но не в Kluyveromyces lactis. Разработаны методики очистки рекомбинантных гидролаз. В результате очистки были получены препараты гидролаз в электрофоретически гомогенном состоянии. Всего получены препараты 55 белков. Проведена отработка методик тестирования активности осахаривающих и бактериолитических гидролаз. На основании разработанных методик разработаны программы исследовательских испытаний рекомбинантных гидролаз. Проведены испытания рекомбинантных гидролаз и отобраны гидролазы с оптимальными свойствами. Проверены различные условия получения кристаллов гидролаз. Получены кристаллы десяти рекомбинантных гидролаз. Проведено культивирование рекомбинантных продуцентов гидролаз в лабораторных ферментёрах. Отработаны оптимальные условия культивирования рекомбинантных продуцентов - состав питательной среды, условия аэрации, концентрация и условия внесения индуктора. Разработаны методы отделения биомассы продуцентов от культуральной жидкости, условия очистки и сушки культуральной жидкости. На основании результатов отработки условий получения ферментных препаратов разработаны лабораторные регламенты получения ферментных препаратов. Получены экспериментальные образцы ферментных препаратов - двух осахаривающих и трёх бактериолитических. Разработаны методики исследования свойств ферментных препаратов. Проведено испытание свойств полученных ферментных препаратов. Показано, что осахаривающие ферментные препараты эффективно снижают вязкость водных экстрактов злаков, обладают высокой термостабильностью, слабокислым оптимумом рН. Бактериолитические препараты эффективно разрушали клеточные стенки бактерий, лизировали клетки патогенных штаммов бактерий, в том числе множественноустойчивых к антибиотикам. Проведён рентгеноструктурный анализ кристаллов для десяти гидролаз. Полученные ферментные препараты для осахаривания кормов животных обладают высокой эффективностью в снижении вязкости экстрактов злаков, высокой термостабильностью. Бактериолитические ферментные препараты эффективно разрушали патогенные штаммы бактерий, в том числе множественноустойчивых к антибиотикам.

Практическая значимость исследования
Ферментные препараты активно используются в сельском хозяйстве. В составе кормов содержатся полисахариды, которые не усваиваются в пищеварительной системе многих сельскохозяйственных животных. Гидролитические ферменты переводят неусваиваемые полисахариды в усваиваемую форму, что повышает питательность кормов и снижает затраты на производство продуктов животноводства. Бактериолитические гидролазы высокоэффективны в лечении и профилактики бактериальных заболеваний животных. Применение препаратов на основе этих ферментов способно понизить заболеваемость скота, а так же является безопасной альтернативой антибиотикам. Большинство ферментов для сельского хозяйства, представленные на российском рынке, иностранного производства. Поэтому разработка новых отечественных ферментных препаратов является актуальной задачей импортозамещения.