Регистрация / Вход
Прислать материал

14.584.21.0002

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.584.21.0002
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет"
Название доклада
Разработка новых подходов в хранении биоматериалов медицинского и сельскохозяйственного назначения
Докладчик
Гусев Олег Александрович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Основной целью проекта является создание научно-технического задела для создания новой технологии хранения живых клеток и белков при комнатной температуре в сухом состоянии без потери жизнеспособности.
Выделение наиболее перспективных участков генома африканской хирономиды (единственного насекомого способного к выживанию без воды - феномену ангидробиоза) несущих регуляторные элементы реагирующих на обезвоживание.
Дизайн и генетические конструкций, несущих регуляторные элементы чувствительные к обезвоживанию и целевые белки. Создание протоколов, позволяющих осуществлять контролируемый медленным обезвоживанием синтез рекомбинантных белков в клетках Pv11. Создание генетических конструкций, несущие регуляторные элементы чувствительные к обезвоживанию (либо реагирующие на сопутствующие сигналы) для экспрессии целевых белков в ооцитах млекопитающих. Сопряженная с обезвоживанием экспрессия защитных белков в клетках млекопитающих и оценка их эффекта на устойчивость к обезвоживанию и заморозке.
Актуальность и новизна исследования
Бурное развитие клеточных технологий и персонифицированный медицины выдвигает новые потребности к биобанкам, где необходимо хранить клетки и ткани на протяжении многих лет и десятилетий. В настоящее время эта проблема решается посредством глубокой заморозки. Это очень энергозависимый процесс. Альтеративой является возможность биомиметических подходов с использованием молекулярных механизмов ангидробиоза - процесса в ряде живых организмах выдерживать полное обезвоживение. Именно сейчас, после расшифровки геномов ряда таких животных, открываются перспективы успешного переноса знаний в этой области в сферу практических биотехнологий.
Описание исследования

Концепция проекта базируется на переносе знаний о механизмах устойчивости к полному обезвоживанию в ангидробиотическом организме, для развития высоковостребованной методологии безводного хранения биоматериалов для медицинских, биотехнологических и сельскохозяйственных нужд. Анализ генома ангидробиотеческого насекомого позволил выделить участки котролирующие работу генов в ответ на обезвоживание. Эти участки содержат промоторы характеризующиеся двумя ключевыми свойствами: они активируют экспресию защитных генов в ответ на обезвоживанием и они позволяют регулировать работу сразу нескольких генов в участке генома. Другим недавним прорывом в изучении ангидробиоза, и сделанным нашими японскими партнерами стало получение модельной клеточной культуры Pv11, полученной из эмбриональной массы хирономиды. Клеки Pv11 под воздествием трегалозы и медленного обезвоживания способны приобретать устойчивость к полному обезвоживанию.

Оба открытия явились импульсом для запуска совместного проекта для разработки наборов генетических конструкций с промоторами чувствительными  к обезвоживанию. Изначально прототипы конструций несут флюоресцентные белки под промоторами чувствительными к обезвоживанию, что позволило подтвердить синтез целевых белков при обезвоживании.

На следующем этапе, конструкции будут разработаны, чтобы сохранить гены, кодирующие десикации чувствительные белки (такие как люциферазы), чтобы позволить синтезировать целевые экзогенные белки в клетках Pv11. Синтез будет в сочетании с высыханием и, в конце концов, белки будут сохранены без потери биологических функций в абсолютно сухом состоянии. Позже, рекомбинантные белки, чтобы быть безопасно восстановлены из сухих Pv11 клеток. Разработанная методология будет использована для широкого спектра биотехнологических и биомедицинских задач, где длительное сохранение нативных белков имеет важное значение. Затем промоторов моноблочной факторы сигнала (на основе белка или РНК на основе транскрипционные факторы) будут идентифицированы в клетках Pv11, так что система может функционировать в клетках млекопитающих. Наконец, набор генных конструкций использоваться в клетках млекопитающих и содержащих транскрипционных факторов, целевой плазмиды с помощью генов, кодирующих защитные белки и ферменты для превращения по потребностям гликогена в трегалозы будет развиваться. Оптимизированы условия для продуцирования трегалозы в клетках млекопитающих, комбинация трегалоза и стрессовые белки, чтобы предотвратить повреждение от иссушения и замерзания, показали многообещающие результаты. На более позднем этапе проекта, с использованием микро-инъекции, генетические конструкции будут введены в клетки млекопитающих для связанной с обезвоживаием индукции синтеза трегалозы и защитных белков. Эффект введения защитных комплектов биомолекул к сопротивлению клеток  к высушиванию и замораживанию изучается  и на завершающем этапе  будет разработан протокол для оптимизации сохранения клеток млекопитающих.

 

Результаты исследования

Интересной и перспективной  группой генов, обнаруженной в геноме хирономиды и экспрессирующейся на высоком уровне во время обезвоживания, являются гены Lea-белков. Эти белки не имеют третичной структуры в растворе, но приобретают ее в условиях обезвоживания. По-видимому, они связываются с другими белками, обеспечивая их сохранность в стрессовых условиях. К третьей группе генов ответа на ангидробиоз являются защитные белки и, прежде всего, к ним относятся антиоксиданты. Гены разных групп антиоксидантов не только мультиплицировались в геноме P. vanderplanki, но и приобрели ярко выраженную модель экспрессии в ответ на стресс обезвоживания.

Показано, что множество генов являются специфичными для вида P. vanderplanki и их ортологи не найдены у других видов животных, в том числе насекомых.  Предполагается, что такое множество генов, выполняющих сходную функцию являются тканеспецифичными т.е. их активность связана с определенным видом клеток. Показано, что устойчивость к обезвоживанию обуславливается высокой концентрацией антиоксидатнов, защитных белков и других необходимых молекул,  что и обеспечивается высокой копийностью генов.

Анализ экспрессионной активности генов клеточной культуры на разных стадиях обезвоживания позволил выявить минимальных набор генов, необходимых для сохранения жизнеспособности при сильных стрессовых условиях. Это значительно упростило выбор генов для гиперэкспрессии в других клетках при создании технологий безводного хранения биоматериала.

озданы экспрессионные векторы несущие промоторы генов активно экспрессирующих в клетках Pv11 в  ангидробизе.

Показана эффективность трансфекции клеток Pv11 созданными генетическими конструкциями.Проведена трансфекция генетических конструкций в клетки Pv11 и осуществлена оценка эффективности экспрессии репортерных генов в ответ на стресс обезвоживания. Подтверждено сохранение активности белка, чувствительного к обезвоживанию (люциферазы) после регидратации обезвоженной культуры клеток Pv11, разработан протокол высушивания культуры.
Проведена оценка профиля экспрессии генов в культуре клеток Pv11 после воздействия стрессов разной природы
(добавление трегалозы, маннитола, раствора NaCl, легкий окислительный стресс.

Проведены эксперименты по созданию генетических конструкций для экспрессии целевых белков в ооцитах
млекопитающих под контролем элементов генома Pv11, чувствительных к обезвоживанию. Созданы
конструкции, несущие защитные белки и ферменты синтеза трегалозы. Отработана методика доставки
векторов, несущих гены интереса в клетки млекопитающих. Показано что экзогенная экспрессия белков хирономиды и присутствие трегалозы значительно повышает устойчивость клеток к заморозке.

Практическая значимость исследования
Проведенная работа позволила сформировать научно-технический задел для последовательного внендрения тактики снижения энергозависимости хранения биологического материала. Дальнейшее развитие этой тематики, в частности, применительно к различным клеткам млекопитающих позволит в недалеком будущем создавать биобанки содержащие исключительно обезвоженные клеточные культуры и ткани без потери из жизнеспособности при нормальной температуре на протяжении многих лет.
Постер

Poster_KFU_NZH-OG.ppt