Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0116

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0116
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук"
Название доклада
Скрининг нейропротекторных соединений-ингибиторов метаболизма глутамина
Докладчик
Красников Борис Федорович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Проект направлен на исследование механизмов нейродегенеративных заболеваний печеночного происхождения и поиск эффективных путей ранней диагностики и успешной коррекции хронических заболеваний печени, приводящих к нейродегенеративным расстройствам. Основная цель проекта заключается в поиске диагностического биомаркера оценки степени развития печёночной энцефалопатии (ПЭ), разработке метода его определения и выявлении мишеней для новых методов лечения энцефалопатий, вызванных нарушениями работы печени.
Идея ПНИ строится на предположении, что концентрация метаболита глутаминового обмена α-
кетоглутаратамата (KГМ) может служить предиктором и маркером для оценки тяжести печёночной
энцефалопатии. Механизм увеличения концентрации этого соединения по ходу прогрессии печёночной
энцефалопатии (ПЭ) остается неизвестным. Выяснение этого механизма является первой и наиболее
важной задачей ПНИ.
Вторая задача проекта состоит в разработке нового метода измерения KГМ в биожидкостях (плазма крови,
моча), что позволит применять его в клинических лабораторных исследованиях.
Актуальность и новизна исследования
Установлено, что более чем в половине случаев (63,4%) цирроз печени,
приводящий к смерти, обусловлен многолетним приемом больших доз алкоголя. Доля алкогольного
цирроза печени у умерших в возрасте 18—65 лет ещё выше — 74%. От него погибло в 3,5 раза больше
больных, чем от всех циррозов печени вирусной этиологии (Маев И.В., Вьючнова Е.С., Использование
гепатопротекторов в лечении заболеваний печени, Медицинский вестник, № (403), 30 мая 2007; Baumberg
B. (2006) The global economic burden of alchol: A review and some suggestions. Drug Alcohol Rev. 25:537-551).
Несмотря на существание множества подходов к лечению циррозов, достигнуть излечения от них, как
правило, не удается, особенно в случае острых форм.
Нейродегенеративное расстройство печеночная энцефалопатия (ПЭ) – одно из наиболее распространенных
и опасных последствий цирроза. Это заболевание является серьезной социальной проблемой многих стран,
включая Россию. Наиболее явным симтомом ПЭ является гипераммониемия – постоянно повышенное
содержании ионов аммония в плазме крови, приводящее к нарушению метаболизма глутамина. Избыток
ионов аммония вызывает нарушения функционнирования центральной нервной системы (ЦНС),
проявляющийся в развитии деменции и других нейрологических дегенеративных симптомов. Существуют
и другие причины повышения содержания аммония в крови, приводящие к схожей клинической картине.
Таким образом, исследования механизмов метаболизма аммония в мозге могут внести существенный вклад
в разработку методов лечения и профилактики социально значимых нейродегенеративных заболеваний.
Описание исследования

         В ходе работ по проекту были проведены следующие исследования:

1) Разработка экспериментальной модели нейродегенеративных заболеваний на основе определения содержания aКГМ в крови, моче и мозге. Разработку экспериментальных моделей нейродегенеративных заболеваний, индуцированных D-галактозамином и CCl4, проводили по следующей схеме:

  1. Моделирование острой гепатопатологии, индуцированной CCl4;
  2. Моделирование подострой гепатопатологии, индуцированной CCl4;
  3. Моделирование гепатопатологии, индуцированной D-галактозамином.

        Моделью патологического состояния служили самцы белых лабораторных крыс линии Wistar и массой 140-150 г, которые подвергались острому отравлению гепатотропным ядом CCl4, индуцирующим направленное повреждающее действие на клетки печени и приводящем к развитию жировой дистрофии и колликвационного некроза. Острое повреждение печени индуцировали интрагастральным принудительным (с помощью зонда) введением раствора 33% CCl4 в вазелиновом масле (64 мкл раствора на 100 г веса животного). Введение гепатотоксиканта проводили утром, в одно и то же время, за 30 мин. до принятия пищи, в течение 7 дней эксперимента. Подострое повреждение печени индуцировали интрагастральным принудительным (с помощью зонда) введением раствора 11% CCl4 в вазелиновом масле (0,4-0,5 мл раствора на 100 г веса животного). Введение гепатотоксиканта проводили дважды в неделю, утром, в одно и то же время, за 30 мин. до принятия пищи, в течение 21 дня эксперимента. Повреждение печени, индуцированное D-галактозамином, проводили путем интрагастрального принудительного (с помощью зонда) введения коллоидного раствора препарата в дозировке 700 мг на кг веса животного. Введение гепатотоксиканта проводили дважды в неделю, утром, в одно и то же время, за 30 мин. до принятия пищи, в течение 21 дня эксперимента. Животные получали типовой рацион вивария в соответствии с нормами, утвержденными приказом Министра здравоохранения СССР от 10.03.1966 г. № 163 и Приказом Минздрава СССР от 10.10.1983 №1179 (п. 4.1). 

2) Исследования ингибиторов ω-амидазы на модели нейродегенерации in vivo.

        Исследования проводились по следующей схеме:

  1. Тестирование соединений-потенциальных ингибиторов ω-амидазы, продемонстрировавших достаточные энергии связывания с активным центром фермента в ходе молекулярного докинга, на способность ингибировать активность нативной ω-амидазы в эксперименте in vitro;
  2. Отбор соединений, обладающих наибольшей ингибирующей способностью, для проведения испытания на лабораторных животных in vivo.

3) Исследования ингибиторов глутаминтрансаминазы на модели нейродегенерации in vivo.

        Исследования проводились по следующей схеме:

  1. Тестирование соединений-потенциальных ингибиторов глутаминтрансаминазы, продемонстрировавших достаточные энергии связывания с активным центром фермента в ходе молекулярного докинга, на способность ингибировать активность нативной глутаминтрансаминазы в эксперименте in vitro;
  2. Отбор соединений, обладающих наибольшей ингибирующей способностью, для проведения испытания на лабораторных животных in vivo.

​4) Обоснование выбора предиктивного диагностического биомаркера для оценки риска развития печёночной энцефалопатии.

 

Результаты исследования

          На 4 этапе работ по проекту была разработана экспериментальная модель нейродегенеративных заболеваний на основе определения содержания aКГМ в крови, моче и мозге, имеющая в основе тетрахлорметан- и галактозамин-индуцированную гепатотоксичность. Полученная модель позволила использовать aKГМ в качестве диагностического биомаркера при развитии ПЭ различной этиологии. В ходе испытаний ингибиторов ω-амидазы и ГТ-К на животной модели установлено, что действие всех испытанных ингибиторов ГТ-К приводило к частичному снижению содержания aКГМ во всех исследованных биологических образцах мозга и крови. Напротив, ингибиторы ω-амидазы, кроме ГГ, оказывали незначительный эффект на содержание aКГМ в биологических образцах экспериментальных животных. Выполнено обоснование выбора предиктивного диагностического биомаркера для оценки риска развития ПЭ. Ярко выраженные изменения содержания маркерных метаболитов в ходе эксперимента по острой интоксикации отмечены в печени животных. Показано возрастание уровня aKГM в мозге на 5-е и 10-е сутки эксперимента и в плазме крови - на 15-е и 21-е сутки опыта по тетрахлорметан- и галактозамин-индуцированной гепатотоксичности. Данные по уровню aKГM в моче экспериментальных животных с индуцированной ПЭ не показали существенных различий в содержании метаболита. Проведен тестовый HPLC-анализ по определению уровней aКГМ в моче пациентов с заболеванием печени, свидетельствующий о том, что, что (а) разработанный метод по определению aКГМ в тканях крыс может быть использован для определения уровней aКГМ в моче человека; (б) при существенном разведении приготовленного экстракта мочи, в одной пробе одновременно можно измерять как уровни aКГМ, aКГ и креатинина, к которому концентрация aКГМ и aКГ в моче должны быть нормализованы; (в) проведенный HPLC-анализ способен выявлять низкий уровень нормализованного к креатинину aКГМ в моче здоровых пациентов и в 3-30 раз повышенный уровень aКГМ а моче пациентов с диагностированным заболеванием печени. На основании выполненных работ можно утверждать, что уровень aКГМ в биологических жидкостях животных (плазма крови) и человека (моча) может быть использован в качестве предиктивного диагностического биомаркера для оценки риска развития ПЭ. Определение маркерных метаболитов αКГМ и αКГ описанным методом, позволяющим одновременно выявлять оба маркера в одном определении, вполне может быть рекомендовано для использования в рутинной клинической практике. Все полученные на этапе результаты отличаются новизной, высокой практической значимостью, оцененной на мировом публикационном уровне, и находятся в полном соответствии с требованиями технического задания и плана-графика выполнения обязательств по проекту.

Практическая значимость исследования
Планируемые результаты ПНИ могут найти непосредственное применение в фармацевтике, клинической
диагностике нейродегенеративных заболеваний и в фундаментальных научных исследованиях
метаболизма азота и физиологии работы мозга.
Конкретно результаты могут быть применены клинике при разработке терапевтических средств и методов
для лечения и диагностики ПЭ. Новый метод диагностики может быть принят в качестве рутинного в
биохимических лабораториях лечебных учреждений и сетевых клинико-диагностических лабораторий.