Регистрация / Вход
Прислать материал

14.578.21.0055

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.578.21.0055
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский технологический университет "МИСиС"
Название доклада
Разработка бислойной биоинженерной конструкции на основе сверхвысокомолекулярного полиэтилена для репаративной хирургии плоских и трубчатых костей с использованием ростовых факторов и клеточных технологий
Докладчик
Максимкин Алексей Валентинович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Разработка технологических решений и инженерных подходов для создания имплантатов нового поколения для репаративной хирургии плоских и трубчатых костей, в частности, ортопедии, с улучшенной остеокондуктивностью и бактерицидностью, обеспечивающей контактный остеогенез на границе имплантат – кость; создание биоинженерных конструкций на основе пористого СВМПЭ для возмещения дефектов костной ткани с использованием протеомных и клеточных технологий, а также методов, основанных на использовании сверхкритических флюидов, оценка их свойств in vitro и in vivo.
Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
- провести аналитический обзор современной научно-технической и патентные исследования затрагивающей научно-техническую проблему
- разработать методы получения СВМПЭ с высокой пористостью
- разработать методы получения сплошного армирующего слоя биоинженерных конструкций.
- провести исследования, устанавливающие взаимосвязь между технологическими параметрами (температура, давление, наличие и концентрация порообразующего агента), структурой исходных компонентов и структурой, свойствами СВМПЭ;
- разработать и исследовать методы осаждения биоактивных покрытий с бактерицидным эффектом на поверхность сплошного армирующего слоя.
- разработать и исследовать методы насыщения СВМПЭ с высокой пористостью белковыми факторами роста и/или ММСК;
- провести биологические исследования экспериментальных образцов имплантатов in vitro
- провести подкожную и ортотопическую имплантацию экспериментальных образцов имплантатов;
- провести сравнительное исследование применения различных подходов для стерилизации биоинженерных конструкций на основе пористого СВМПЭ;

Актуальность и новизна исследования
В последние годы наблюдается тенденция возрастания роли имплантационной хирургии. В частности, часто наблюдаются клинически обусловленные ситуации, когда в результате обширных травм или врожденных пороков развития, возникает необходимость в реконструкции дефектов костной ткани. Восстановление костей опорно-двигательной системы является чрезвычайно важным и актуальным разделом ортопедии, онкологии, травматологии и медицины в целом. У онкологических больных потребность в замещении костных фрагментов возникает как вследствие деструкции тканей в результате опухолевого процесса, так и вследствие расширенных хирургических вмешательств.
В различные периоды развития хирургии для замещения дефектов кости использовали разные материалы: биокерамические материалы, металлы, аутотрансплантаты и т.д. В настоящее время все большую популярность приобретает протезирование с использованием синтетических материалов. Использование полимерных протезов для замещения дефектов нашло уже широкое применение в травматологии и ортопедии, а также у онкологических больных с остеосаркомами. Одним из наиболее перспективных полимерных материалов для использования в имплантологии является сверхвысокомолекулярный полиэтилен (СВМПЭ). Создание биоинженерных конструкций на основе СВМПЭ, обладающего программируемой пористой структурой, с использованием протеомных и клеточных технологий, а также методов, основанных на использовании сверхкритических флюидов, позволить выйти на новый уровень создания материалов для протезов костей, решив целый ряд проблем, связанных с заменой дефектов костной ткани и влиянием на организм человека в целом, что дает возможность снизить количество ревизионных операций.
Описание исследования

На рисунке 1 представлено схематическое изображение двухслойной биоинженерной конструкции – имитирующей трубчатую костную ткань. В качестве основного материала имплантата использовался СВМПЭ. Для придания СВМПЭ остеокондуктивных свойств полимер должен обладать пористостью. Формирование пористой структуры в СВМПЭ сопровождается трудностями, связанными с высокой молекулярной массой, и невозможностью применения к нему традиционных методов вспенивания и порообразования. Для формирования программируемой пористой структуры в СВМПЭ нами были опробованы различные методы, такие как: спекание, спекание под давлением и введение порообразующего наполнителя с последующим термопрессованием. Наилучшие результаты показал метод, основанный на введении в полимер легкорастворимого наполнителя, с последующим его выщелачиванием, и образованием пор в местах растворения наполнителя. Регулируя размер наполнителя и его концентрацию, мы можем проектировать поры заданного размера и регулировать общую пористость полимера. Введение легкорастворимого наполнителя в СВМПЭ проводилось в твёрдом состоянии, с использованием мельницы планетарного типа. Смешение порошков осуществлялось в корундовых барабанах, c использованием смешивающих тел выполненных из корунда, для предотвращения нежелательного намола. В ходе работы были получены материалы с содержанием порообразующего наполнителя от 30% до 80 % масс.

Рисунок 1 - Биоинженерная конструкция на основе СВМПЭ, имитирующая трубчатую костную ткань.

Для формирования сплошного слоя СВМПЭ биоинженерной конструкции были опробованы различные режимы термопрессования СВМПЭ. Также был разработан метод позволяющий совмещать пористый и сплошной слой СВМПЭ в биоинженерной конструкции на молекулярном уровне.

Для всех экспериментальных образцов СВМПЭ, имеющих пористую и сплошную структуру, был проведён комплекс механических и структурных исследований, который позволил установить взаимосвязь между технологическими параметрами изготовления образцов, их структурой и проявляемыми свойствами.

Был проведен сравнительный анализ эффективности стерилизации экспериментальных образцов биоинженерных конструкций с использованием различных методов: стерилизация спиртом, сухим жаром, в автоклаве, а также при помощи разработанной лабораторной установки в среде сверхкритического диоксида углерода. Все образцы после стерилизации исследовались на предмет их окисления и нежелательных структурных перестроек в полимере. Был произведен контроль стерильности образцов.

Полученные экспериментальные образцы СВМПЭ с пористой и сплошной структурой были исследованы методами in vitro (индуцированный гемолиз, индекс выживаемости лейкоцитов крови, цитоиндукутиность).

Для формирования антибактериального покрытия на сплошном слое СВМПЭ был выбран антибиотик амоксициллин. Импрегнация амоксициллина в СВМПЭ осуществлялась в среде сверхкритического диоксида углерода. На экспериментальных образцах сплошного слоя СВМПЭ с бактерицидным эффектом был изучен эффект торможения колониеобразования микроорганизмов после коинкубации.

Для активации репаративных процессов пористый слой биоинженерной конструкции заселяли белковым ростовым фактором TGF-β и/или ММСК клетками. В качестве источника ММСК использовали спонгиозную массу костного мозга диафиза бедренных костей мышей линии C57BL/6J. Генерацию целевой культуры осуществляли согласно методике S. Baiguera. Генерация культуры ММСК сопровождалась оценкой морфологии культуры, цитологических и фенотипических особенностей составляющих ее клеток.

Были получены экспериментальные образцы имплантатов, состоящие из пористого и сплошного слоёв СВМПЭ, где сплошной слой имел антибактериальное покрытие, а пористый слой был насыщен одним из следующих составов: TGF-β, TGF-β и ММСК или ММСК. С использованием полученных имплантатов была проведена гетеротропная и ортотопическая трансплантация лабораторным животным. При гетеротропной трансплантации имплантаты были имплантированы в подкожный карман, сформированный в области спины между подкожной фасцией и широчайшей мышцей спины. Ортотопическая трансплантация имплантатов была проведена в дефект диаметром 2 мм, сформированный в области перехода диафиза в краниальный эпифиз большеберцовой кости.

 

Результаты исследования

Были получены экспериментальные образцы высокопористого СВМПЭ, обладающие высокой пластичностью, объёмной пористостью до 80%, с открытыми проходными порами. Размер пор может легко регулироваться в диапазоне от 80 мкм до 700 мкм. На рисунке 2 представлена фотография пористой пластины СВМПЭ и биоинженерной конструкции, имитирующей костную ткань. СЭМ этих образцов показывает большое сродство формируемой пористой структуры полимера со структурой трабекулярной костной ткани.

Рисунок 2 - Фотография и СЭМ образцов на основе СВМПЭ

На рисунке 3 представлены диаграммы нагружения биоинженерной конструкции и СВМПЭ с объёмной пористостью 80% при механических испытаниях на сжатие. В процессе испытаний не наблюдалось отслоений пористого слоя СВМПЭ от сплошного.

Рисунок 3 - Диаграммы нагружения 1- СВМПЭ с пористой структурой и 2- биоинженерной конструкци

Экспериментальные образцы СВМПЭ с высокой пористостью после стерилизации в среде сверхкритического диоксида углерода, продемонстрировали отсутствие признаков колониеобразования как бактерий, так и грибов в специализированной питательной среде. В отличие от других использованных методов стерилизации СВМПЭ стерилизация в среде сверхкритического диоксида углерода не приводит к окислению полимера и изменению его структуры.

Исследования in vitro показывали, что интенсивность гемолиза индуцированного всеми экспериментальными образцами в среднем соответствовала  5,5 ± 3,2 %, интенсивность гибели лейкоцитов 2±2,8%. Экспериментальные образцы биоинженерных конструкций, насыщенных TGF-β и ММСК, обладают выраженной цитокондуктивностью, обеспечивая преимущественные условия для культивирования клеток соединительной ткани. Исследования образцов СВМПЭ, с бактерицидным покрытием позволило констатировать эффект торможения роста колоний грампозитивных и грамнегативных микроорганизмов. Полученные культуры ММСК характеризовалась отсутствием мембранносвязанных маркеров гемопоэтических клеток – в конечной популяции относительная концентрация CD34+, CD 45+ не превышала 11%, наличием на мембране большого количества интегринов CD11c, а также экспрессией CD90 и CD 105 – в конечной популяции относительная концентрация этих мембранносвязанных маркеров была выше 80%.

Результаты гетеротропной трансплантации показали, что для всех типов имплантатов наблюдается плотная интеграция в прилегающую соединительную ткань: как в мышечную, так и в подкожную фасции. Пористая часть образцов была интенсивно васкуляризирована с прорастанием соединительной ткани. Спустя 3 дня после ортотопической трансплантации животные полностью опирались на прооперированную конечность, функции сгибания/разгибания конечности в коленном суставе выполнялись в полном объеме. У животных контрольной группы конечность не несла опорной функции в течение всего периода наблюдения. Для всех групп имплантатов гистологических анализ показал, сплошной слой имплантата покрыт плотно прилегающей тканью, морфологически ассоциированной с надкостницей, что свидетельствует о цитокондуктивности материала. Пористый слой имплантатов, нагруженных ММСК, заполнены тяжами соединительной ткани плотно прилегающими друг к другу. В пористом слое имплантатов, нагруженных TGF-β, волокна соединительной ткани расположены более рыхло. Имеется большое количество новых довольно крупных сосудов. Имплантаты, нагруженные ММСК+TGFβ, по характеру клеточно-тканевого состава, занимают промежуточное положение.

Практическая значимость исследования
Разработка собственной технологии получения эффективных биоинженерных конструкций на основе СВМПЭ позволить выйти на новый уровень создания материалов для протезов костей, решив целый ряд проблем, связанных с заменой дефектов костной ткани и влиянием на организм человека в целом, что дает возможность снизить количество ревизионных операций. Биоинженерная конструкция не имеет аналогов на российском рынке из-за выдающихся в сравнении с традиционными материалами цитокондуктивных и цитоиндуктивных свойств, в том числе с не наполненным СВМПЭ.
Конкурентными преимуществами разработанных биоинженерных конструкций является их надежность в процессе эксплуатации за счет сочетания высоких механических и биологических характеристик.
Разрабатываемые материалы имеют несомненные преимущества по остеокондуктивным свойствам, а также по технологии их изготовления и возможности получения материалов практически любой, сколь угодно сложной формы, без существенной усадки. Такие материалы выгодно отличаются экологичностью, так как не содержат токсичных примесей. Их использование должно позволить выйти на новый уровень осуществления восстановительных хирургических операций.
Постер

0055_NZH.ppt