Регистрация / Вход
Прислать материал

14.613.21.0033

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.613.21.0033
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Название доклада
Перепрограммирование активности микробного комплекса иммунной интерференции путем направленного встраивания в его состав функциональных модулей.
Докладчик
Деев Сергей Михайлович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целью проекта является разработка инструментария, позволяющего включать удобным образом в состав интерферирующего комплекса (ИК) Crispr/Cas различные белковые функциональные модули (ФМ).
Задачами проекта являются:
1. получение рекомбинантных продуцентов аффинных тагов (АТ) и белковых компонентов Crispr/Cas системы; изучение и выбор оптимальной пары АТ
2. конструирование химерных белковых конструкций ФМ-АТ и ИК-АТ; определение количественных параметров, характеризующих комплексообразование ФМ-АТ и ИК-АТ
3. перепрограммирование ИК с целью придания ему функции регулятора транскрипции
Актуальность и новизна исследования
Анализ современной научно-технической литературы и патентной документации доказывает инновационность концепции, реализуемой в проекте. Ее востребованность проистекает из того мощного потенциала, который дает Crispr/Cas система.
Данный проект нацелен на то, чтобы придать гибкость этому уникальному инструментарию и облегчить работу с ним.
Описание исследования

В настоящее время проблема изменения функциональности Crispr/Cas решается за счет ковалентного присоединения к его белковым компонентам различных функциональных блоков белковой природы, например, активаторов или же репрессоров транскрипции. Очевидным недостатком такого рода подхода является отсутствие гибкости в построении комплексов различной функциональности. Значительные усилия прикладываются для создания гибридной конструкции способной выполнять только узкоспециализированную задачу. Применение аффинных тагов позволяет реализовать модульный принцип построения Crispr/Cas комплекса, что сильно упрощает задачу изменения его функциональности. Однажды проведенная работа по введению тага в один из белковых компонентов Crispr/Cas системы позволяет в дальнейшем присоединять к нему любой из функциональных блоков, снабженных парным тагом. Благодаря этому будет достигаться большой экономический эффект за счет снижения финансовых издержек при разработке интерференционного комплекса требуемой функциональности.

Результаты исследования

Идея модульного построения ИК была реализована на примере регуляции активности репортерного гена GFP в клетках млекопитающих линии SK-BR-3 (ER-негативных).

   Клетки млекопитающих ко-трансфецировали смесью трех плазмид в равной пропорции при помощи Lipofectamine®2000 . Одна из плазмид обеспечивала синтез белка ИК, снабженного одним из АТ, и tracrРНК. Последние были запрограммированы заранее на узнавание сайтов в пределах промотора репортерного гена. ИК был снабжен сигналом ядерной локализации, благодаря которому он может поступать в клеточное ядро и связываться с промотором репортерного гена. Другая плазмида направляла синтез LBD рецептора эстрогена, снабженного парным АТ. В экспериментах был использован укороченный вариант рецептора эстрогена, лишенный ДНК-связывающего домена. Этот вариант – лиганд-связывающий домен (LBD) –  не способен связываться с ДНК, однако, способен связывать лиганд (эстроген) и активировать транскрипцию. Третья плазмида содержала репортерный ген EGF под контролем промотора, регулируемого эстрогеном. Флуоресценцию ко-трансфецированных клеток наблюдали при помощи флуоресцентного микроскопа. В предварительных экспериментах было установлено, что активность репортерного гена находится в зависимости от концентрации эстрогена в культуральной среде (см. рисунок).

   Работа была выполнена в сотрудничестве с Центром функциональных геномных исследований, Корейский исследовательский институт биологических наук и биотехнологии, Тэджон, проф. Е. Дж. Ву. Корейской стороной был выполнен весь комплекс молекулярно-биологических и биохимических работ, связанных с системой Crispr/Cas.

 

Практическая значимость исследования
Методология перепрограммирования функционала Crispr/Cas системы при помощи аффинных тагов, безусловно, найдет широкое применение в науке, медицине и биотехнологии. В широком смысле методология применима также к любым другим белковым комплексам для включения в их состав новых функциональных модулей. Практическое внедрение полученных результатов будет достигнуто путем модификации белковых компонентов ИК при помощи АТ. Модифицированные таким образом компоненты ИК будут востребованы при разработке новых технологий, основанных на CRISPR/Cas системе, или же усовершенствовании существующих технологий. Модульный принцип построения ИК дает возможность формулировать принципиально новые технические решения. Например, к одному и тому же белковому компоненту ИК можно обратимым образом добавлять различные функциональные модули, влияя тем самым на его характеристики.