Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0108

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0108
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук"
Название доклада
Получение штаммов-продуцентов сульфидов металлов из окисленных осадочных отложений хвостохранилищ добычи полиметаллических руд с использованием микробиологических, биохимических и геномных технологий.
Докладчик
Пименов Николай Викторович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Разработка биотехнологического метода извлечения металлов из отходов горнодобывающей промышленности на основе ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов, а также выделение новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов из окисленных осадочных отложений хвостохранилищ добычи полиметаллических руд.
Задачи ПНИ включали:
• изучение состава микробных сообществ ацидофильных аэротолерантных сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) из осадков хвостохранилищ предприятий Новокузнецкого бассейна (Кузбасс) с помощью методов высокопроизводительного секвенирования;
• выделение в чистые культуры ацидофильных СРБ, устойчивых к окислительному стрессу, изучение их устойчивости к ионам тяжелых металлов и активным формам кислорода;
• проведение полногеномного секвенирования не менее двух новых штаммов СРБ, характеризующихся высокой устойчивостью к суммарной концентрации тяжелых металлов не менее 500 мг/л и начальному рН среды не выше 2.5;
• поиск в геноме генетических кластеров, ответственных за устойчивость выделенных штаммов ацидофильных СРБ к ионам металлов (Сu, Zn), низким значениям рН и окислительному стрессу;
• проведение исследований по извлечению сульфидов металлов (Сu, Zn) из отходов горнодобывающей промышленности с помощью новых штаммов СРБ, химический анализ осадка сульфидов металлов, образованного в процессе культивирования штаммов СРБ;
• разработка технических требований использования одностадийной биотехнологии извлечения металлов с использованием ацидофильных сульфидогенных бактерий.

Актуальность и новизна исследования
Развитие горнодобывающей промышленности и металлургии сопровождается значительным накоплением отходов, обогащенных тяжелыми металлами. Длительное хранение хвостов флотации и шлаков из-за доступа воды и кислорода приводит к активации в отвалах биогенных процессов окисления минералов и образованию кислых сточных вод, содержащих ионы тяжелых металлов (железа, никеля, цинка, меди) и сульфат-ион. Поэтому развитие эффективных способов очистки вод, загрязненных тяжелыми металлами и сульфатами - одно из наиболее перспективных направлений современной биотехнологии. Нидерландская компания Paques, являющаяся мировым лидером в области создания биотехнологий осаждения металлов под действием сульфидогенных микроорганизмов, разработала технологию, основанную на использовании двухстадийного осаждения тяжелых металлов: на первой стадии консорциумом сульфатредуцирующих бактерий образуется сероводород, а на второй стадии в другом реакторе происходит химическое осаждение сероводородом из раствора растворенных тяжелых металлов. Используемые микроорганизмы не могут осуществлять процесс в условиях низкого рН, поэтому и был предложен двухстадийный процесс. Использование ацидофильных/ацидотолерантных штаммов-продуцентов сульфидов металлов, устойчивых к металлам, кислороду и повышенной концентрации протонов, открывает перспективы создания одностадийного однореакторного процесса вместо двухстадийного, что приведет к существенному снижению затрат и повышению эффективности разрабатываемой биотехнологии.
Описание исследования

Были отобраны пробы осадков хранилищ отходов горно-обогатительных комбинатов Кузбасса (хвостохранилище «Центральное» и «Комсомольское» Тисульского района Кемеровской области). Были определены основные характеристики осадков (pH, Eh, химический и минеральный состав осадков). На основании прямого определения скорости сульфатредукции радиоизотопным методом с использованием 35S-SO42- были отобраны образцы, которые далее использовали для поиска сульфатредукторов в образцах кислых осадков хвостохранилищ метагеномным анализом. На первом этапе полученные чтения собирались в протяженные контиги с помощью программы GS DeNovo assembler. Затем в полученных контигах был осуществлен поиск генов 16S рибосомных РНК, которые в настоящее время являются общепризнанными филогенетическими маркероми для идентификации микроорганизмов. В результате было обнаружено 4 контига, содержащих полные гены 16S рРНК. Далее путем сравнивания с базой данных NCBI были идентифицированы ближайшие родственные микроорганизмы. Анализ полных генов 16S рРНК позволяет выявить виды микроорганизмов, для которых хорошо собрались гены 16S рРНК. Однако для минорных компонентов микробного сообщества полностью собрать гены 16S проблематично. Поэтому мы провели таксономический анализ микробного сообщества вторым способом на основе вариабельного фрагмента гена 16S рибосомной РНК длиной 500 нуклеотидов, который был амплифицирован с помощью универсальных вырожденных праймеров PRK341F (CCTACGGGRBGCASCAG) и PRK806R (GGACTACYVGGGTATCTAAT). Полученный ПЦР фрагмент очищали и затем проводили его секвенирование с помощью геномного анализатора GS FLX. В результате было получено 137426 независимых нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК. Таксономический анализ полученных последовательностей проводили с помощью программ RDP Classifier.

Из отобранных проб осадков были выделены накопительные культуры ацидофильных сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) на лактате, этаноле, пептоне и формиате, способные к росту при начальных низких значениях рН среды 2.5 и перспективные для проведения дальнейших исследований. Изучение ультраструктуры бактериальных клеток проводили методом трансмиссионной электронной микроскопии с использованием электронного просвечивающего микроскопа “JEM-100 CXII” (“JEOL”, Япония). Состав культур был исследован с помощью денатурирующего градиентного гель электрофореза фрагментов генов 16S рРНК. В пробах были обнаружены филотипы СРБ родов Desulfosporosinus, Desulfotomaculum и Desulfovibrio. Из полученных накопительных культур удалось выделить ряд чистых культур СРБ: Desulfosporosinus sp. OL и Desulfosporosinus sp. I2, Desulfovibrio sp. OI. , у двух из которых был определен полный геном. Геномную ДНК штаммов СРБ секвенировали методом пиросеквенирования на секвенаторе Roche Genome Sequencer GS FLX. Приготовление библиотеки случайных фрагментов геномной ДНК (shotgun library) проводили по протоколу Rapid Library Preparation Method Manual. Амплификацию фрагментов библиотеки проводили с помощью ПЦР в водно-масляных эмульсиях с последующим обогащением микрочастиц с ДНК в соответствии с методикой emPCR Method Manual – Lib-L SV. Секвенирование полученной амплифицированной библиотеки геномной ДНК проводили с использованием пиросеквенатора GS FLX по протоколу Titanium XL+ на 1/2 пикотитровальной платины GS Titanium PicoTiterPlate Kit 70x75.

Для изучения образования нерастворимых сульфидов штаммы СРБ культивировали при рН 2,7 на среде с лактатом. Изучали образование нерастворимых сульфидов металлов при добавлении в среду ионов меди в концентрации 100 мг/л и культивировании в течении 16 суток, 28 суток и 77 суток. Образованные в ходе культивирования нерастворимые осадки перед анализом концентрировали при 5000g 10 мин и высушивали на воздухе. Элементный анализ проводили методом сканирующей электронной микроскопии с помощью микроанализатора EDAX. Наличие кристаллических фаз образованных минералов изучали методом рентгеноструктурного анализа на дифрактометре Shimadzu XRD 600.

Результаты исследования

В ходе выполнения ПНИ были задействованы самые современные методы и подходы, обеспечивающие мировой уровень проведенных исследований и подтверждающие способность СРБ активно функционировать в окисленных кислых осадочных отложениях хвостохранилищ, обогащенных ионами тяжелых металлов.

На основе метагеномного анализа в пробах осадков хвостохранилища «Комсомольское» были выявлены СРБ, относящиеся к дельта-протеобактериям (Desulfobulbus, Desulfopila, Desulfocapsa, Desulfatirhabdium, Desulfovibrio, Desulfobacca, Desulfomonile) и к филуму Firmicutes (Desulfosporosinus).

Из осадочных отложений хвостохранилищ добычи металлов выделены чистые культуры СРБ Desulfosporosinus sp. I2 и Desulfosporosinus sp. OL, характеризующиеся ацидофильным ростом и высокой устойчивостью к тяжелым металлам. Выбранные штаммы восстанавливали сульфат с образованием сероводорода при начальном рН среды 2,5, устойчивы к концентрациям кислорода в газовой фазе не менее 0,02 % и обладали устойчивостью к ионам меди, цинка, никеля, кобальта и кадмия в повышенных концентрациях, суммарно превышающих 500 мг/л.

 Определены нуклеотидные последовательности геномов двух новых штаммов ацидофильных СРБ - Desulfosporosinus sp. I2 и Desulfosporosinus sp. OL. В результате пиросеквенирования и сборки драфт-генома Desulfosporosinus sp. I2 получено 318 контигов длиной более 500 п.о. с размером контига N50 в 30483 п.о. Аннотация последовательности генома показала 5512 потенциальных белок-кодирующих генов, из которых 3987 (72 %) могут быть функционально значимыми. Геном аннотирован в базу данных референсных последовательностей (RefSeq) NCBI под номером NZ_JYNH00000000.1. В результате пиросеквенирования и сборки генома Desulfosporosinus sp. OL получено 290 контигов длиной более 500 нт. Размер генома составляет около 4.9 млн. нт. Были определены оперон 16S-23S-5S рРНК и 47 генов тРНК, кодирующих все 20 аминокислот. Аннотация последовательности генома выявила 5871 потенциальных белок-кодирующих генов, для 3934 (67 %) из которых могут быть предсказаны функции. Проект по секвенированию генома штамма Desulfosporosinus sp. OL зарегистрирован в базе данных NCBI под номером PRJNA338386.

В аннотированных геномах СРБ Desulfosporosinus sp. I2 и OL проведен поиск генетических кластеров, ответственных за устойчивость штамма к высоким концентрациям солей металлов, низким значениям рН, а также окислительному стрессу. Устойчивость к металлам обусловлена присутствием в геноме АТФаз П-типа (транспортирующих Cu2+ и Ag2+, а также Zn2+, Cd2+, и Pb2+), RND (Resistance-Nodulation-Division) транспортеров и белков семейства CDF (cation diffusion facilitators), участвующих в диффузии катионов. Обнаруженные в геноме штаммов I2 и OL системы детоксикации кислорода представлены генами супероксиддисмутазы и каталазы, а также окисдоредуктазы. Устойчивость к низким рН связана с присутствием в геноме K+-транспортирующих белков KtrB и TrkA, а также протон-потребляющих декарбоксилаз, таких как аргинин декарбоксилаза Adia и лизин декарбоксилаза CadA.

В ходе проведенных работ по культивированию штаммов СРБ с добавлением ионов меди в концентрации 100 мг/л получены биогенные осадки, в которых присутствуют кристаллические фазы сульфидов меди (ковеллин и халькопирит). Трансмиссионная электронная микроскопия ультратонких срезов клеток показала присутствие микрочастиц сульфидов как в культральной среде, так и на поверхности клеточной стенки.

Практическая значимость исследования
Проведенные в ходе выполнения ПНИ исследования позволили выделить и описать новые, ранее неизвестные, штаммы сульфатредуцирующих бактерий, способные осуществлять процесс сульфатредукции при низких значениях рН, в присутствии кислорода и высоких концентраций ионов тяжелых металлов. Выявленные свойства делают выделенные штаммы перспективными для использования в биотехнологических процессах очистки сточных вод от сульфатов и тяжелых металлов. Полученные результаты обладают несомненной фундаментальной и прикладной ценностью, поскольку имеющиеся на данный момент сведения о разнообразии ацидофильных сульфатредукторов и устойчивости их к неблагоприятным факторам среды являются весьма ограниченными, что препятствует активному развитие новых биотехнологий очистки кислых сточных вод с использованием СРБ.
Проведенный сравнительный анализ мирового опыта очистки кислых рудничных вод показывает, что биологические методы очистки являются весьма перспективной и конкурентоспособной технологией. В то же время, количество компаний на рынке, предлагающих разработки в данной области, весьма ограничено, а на отечественном рынке они фактически отсутствуют. Внедрение активных биологических систем очистки рудничных вод в России является актуальной проблемой, поскольку развитие горно-добывающей промышленности и металлургических предприятий приводит к катастрофическим экологическим последствиям. Поэтому развитие исследований, направленных на усовершенствование известных и разработку новых биотехнологий очистки кислых сточных вод с высоким содержанием тяжелых металлов, может дать результаты, востребованные на рынке технологий очистки промышленных стоков.