Регистрация / Вход
Прислать материал

14.616.21.0011

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.616.21.0011
Тематическое направление
Индустрия наносистем
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"
Название доклада
Разработка наносенсорной биомагнитной тест-системы на основе нуклеиновых кислот для быстрого детектирования заболеваний разной этиологии
Докладчик
Кленов Николай Викторович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
1.Общей задачей, на решение которой направлен реализуемый проект, является разработка недорогой портативной чувствительной диагностической аппаратуры для быстрого проведения иммунного анализа в точке обслуживания пациента. Все существующие в настоящее время высокочувствительные методики проведения иммунного анализа на практике реализуются в биоаналитических лабораториях. Используемые приборы имеют большие размеры и высокую стоимость и не доступны в точке обслуживания пациента, как следствие этого время, требуемое на анализ, исчисляется часами.
2. Конкретной целью реализуемого проекта является разработка наносенсорной биомагнитной тест-системы на основе нуклеиновых кислот для быстрого детектирования заболеваний разной этиологии, в первую очередь, онкологических. Проект направлен на создание методик и аппаратуры для реализации безразделительной схемы иммуноанализа с использованием магнитных наночастиц и чувствительного магнитометра, регистрирующего изменение скорости броуновской релаксации магнитных наночастиц при связывании присоединенных к ним аптамеров с белками-мишенями, как это делается для пары антитело-антиген.
Актуальность и новизна исследования
Полученные результаты являются новыми, подготовлены и опубликованы статьи в журналах, индексируемых системой Web of Science. Перечислим наиболее значимые элементы новизны научных (технологических) решений и применявших методик , вошедшие в упомянутые публикации.
Комплексы АТР-зависимой LON-протеазы и ДНК аптамеров с G-квадруплексной структу-рой как модель для разработки наносенсорной биомагнитной системы безразделительного им-мунного анализа. Показано, что функционализированные стрептавидином магнитные наночастицы (МНЧ) посредством биотинилированных ДНК-аптамеров с G квадруплексной структурой специфически связываются с Lon-протеазой и могут быть использованы для выявления присутствия Lon-протеазы в биологических источниках с помощью наносенсорной биомагнитной системы безразделительного иммуноанализа. Авторами отработаны условия связывания целевых аптамеров с функционализированными МНЧ для использования полученных комплексов.
Регистрация броуновской релаксации магнитных наночастиц с помощью ВТСП СКВИДа. Выполнен анализ чувствительности безразделительной схемы иммуноанализа с использованием функционализи-рованных магнитных наночастиц (МНЧ) и чувствительного ВТСП СКВИД-магнитометра. Сиг-нал от образца объемом 100 мкл с концентрацией 1 мг/мл в поле 7.5 нТл составил 20 мФ0. При полосе усреднения 1 Гц для СКВИДа с уровнем шума интерферометра 10^(-5) Ф0/Гц^(1/2) отношение сигнал/шум равное 1 будет получено в разовом измерении без накопления сигнала при кон-центрации 0.5 мкг/мл, что позволяет получить чувствительность в диапазоне 50 нг/мл при временных затратах в 100 секунд на точку в частотном спектре.
Описание исследования

На первом этапе выполнения проекта были обоснованно выбраны направления исследований, методов и средств проведения исследований. На втором – разработана общая структура измерительной ВТСП СКВИД- системы. Разработаны методики характеризации структуры модифицированных ДНК-аптамеров и белковых мишеней, включающие использование явления кругового дихроизма и плазмонного резонанса. Разработана методика присоединения биотинилированного ДНК-аптамера к магнитным частицам различного размера. На третьем этапе выполнена сборка и отладка измерительной установки на основе ВТСП СКВИД-магнитометра и проведена ее калибровка. Разработаны методики характеризации экспериментальных образцов аналита с пришитыми к магнитным наночастицам специфическими аптамерными комплексами рентгенофазовым анализом, аминокислотным анализом, динамическим светорассеянием и электронной микроскопией. Показано, что иммобилизация биотинилированных аптамеров к ИЛ6 и биотинилированных аптамеров к Lon-протеазе на МЧ-стрептавидин составляет от 19% до 29% от общего их количества.

На данном, четвертом, этапе проекта изготовлены экспериментальные образцы аналита с пришитыми к магнитным наночастицам специфическими аптамерными ДНК, измерены электрофизические характеристики   магнитных частиц в подготовленных  биологических жидкостях. Совместно с иностранным  партнером были выполнены измерения образцов биохимических аналитов приготовленных российской стороной (аптамеры, образовавшие комплексы с белком) на разрабатываемой ВТСП СКВИД-системе (в диапазоне частот 2 Гц – 50 кГц при значениях амплитуды поля подмагничивания 0.5 мТл) для функционализированных магнитных наночастиц с размером по результатам оптических измерений от 68 до 160 нм и исходной концентрацией 1мг/мл. Для получения воспроизводимых стабильных результатов был создан и апробирован жестко закрепляемый на окне криостатата  микрофлюидный канал для дозируемой подачи анализируемого вещества.

Результаты получены в сотрудничестве с иностранным партнером, являющимся одним из мировых лидеров в разработках данного типа, и соответствуют мировому уровню. В частности, отметим, что большинство широко используемых на практике методов иммуноферментного анализа включают стадии разделения иммунореагентов, а затем отмывки непрореагировавших иммунокомпонент. Безразделительный анализ, совершенствуемый в рамках данного исследования, не требует отделения свободных антигенов от связанных с антителами и позволяет значительно сократить время его проведения. Однако, выделение сигнала от связанного с антителами материала на фоне несвязанного требует использования высокочувствительного регистрирующего прибора каким и является сверхпроводящий квантовый магнитометр – СКВИД.

Результаты исследования

В ходе выполнения проекта выполнены следующие работы:

1. Изготовлены экспериментальные образцы аналита с пришитыми к магнитным наночастицам специфическими аптамерными ДНК.

2. Проведены измерения с биохимическим аналитом совместно с иностранным партнером.

3. Отработаны методики по подготовке биологических жидкостей (плазма крови, слюна) дляпроведение модельных экспериментов in situ.

4. Отработаны методики пробоподготовки биологических жидкостей: обессоливание, удаление тяжелых металлов, оценка белкового состава электрофоретическими методами.

5. Проведены измерения электрофизических характеристик магнитных частиц в подготовленных биологических жидкостях.

6. Подготовлена заявка на патент, защищающий результаты интеллектуальной деятельности, полученные в рамках проекта.

За счет внебюджетных средств:

7. Выполнены измерения с биохимическим аналитом совместно с российским партнером.

8. Проведен анализ результатов измерений.

9. Проведена оптимизация технологического процесса создания измерительной ВТСП СКВИД-системы.

10. Подготовлено ТЗ на ПНИЭР.

Полученные результаты были использованы при создании двух статей опубликованных (принятых к печати) в журналах, индексируемых системами WebofScience и Scopus:

  1. The Use of Artificial Neural Networks for Classification of Signal Sources in Cognitive Radio Systems (на русском языке:Использование искусственных нейронных сетей для классификации источников сигналов в системах когнитивного радио), опубликована в журнале Programming and Computer Software;
  2. Obtaining DNA aptamers to human interleukin-6 for biomagnetic immunoassay nanosensor (на русском языке: Получение ДНК-аптамеров к интерлейкину-6 человека для создания наносенсорной биомагнитной системы безразделительного иммунного анализа), опубликована в журнале Moscow University Physics Bulletin;

В рамках перечисленных работ были, соответственно:

  1. опубликованы полученные в рамках проекта математические решения, позволяющие эффективно обрабатыватьпоступающие на детектор сигналы от различных источников магнитных полей в исследуемом аналите;
  2. описаны полученные ДНК-аптамеры к белку интерлейкин-6,  сродство которых  к белковой мишени охарактеризовано методом поверхностного плазмонного резонанса. Показано, что биотинилированная форма аптамеров связывается с магнитными  наночастицами, функционализированными стрептавидином.

Также был получен результат интеллектуальной деятельности, защищенный заявкой на патент №2016124000 от 17.06.2016 «Высокотемпературная сверхпроводящая пленка на кристаллической кварцевой подложке и способ ее получения», РФ.

Результаты проводимых работ частично вошли в диссертацию исполнителя проекта Черных И. А. «Многослойные эпитаксиальные структуры сверхпроводник-интерслой для увеличения токонесущей способности сверхпроводящих лент второго поколения» (специальность:01.04.07 – физика конденсированного состояния), успешно прошедшую защиту в диссертационном совете Д 002.114.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института кристаллографии им. А.В. Шубникова Российской академии наук. Отработанные технологии создания токонесущий сверхпроводящих лент были положены в основу найденных в ходе проекта решений, позволяющих создавать  трансформаторы магнитного потока и аксиальные градиометры для сверхпроводящих квантовых магнитометров (СКВИДов).

Практическая значимость исследования
В прикладном плане разрабатываемая наносенсорная биомагнитная тест-система на осно-ве магнитных наночастиц с иммобилизованными аптамерами к белкам, ускоряющим развитие онкологических заболеваний, таким, например, как интерлейкин-6, а также Lon-протеаза, сопро-вождающая сборку онкобелков, будет основой нового поколения диагностической медицинской аппаратуры.
Области применения и способы использования ожидаемых научных и научно-технических результатов данного поискового исследования определены содержанием и целями проекта. Разрабатываемый новый способ безразделительного иммуноанализа после его оптимизации будет применяться в биохимических лабораториях мира.
Внедрение новых методов быстрого детектирования заболеваний (включая онкологические) вне всяких сомнений приведет к снижению риска смертности и повышению качества жизни населения.
Коммерциализации подлежит напосредственно разрабатываемая наносенсорная биомагнитная тест-система на основе магнитных наночастиц с иммобилизованными аптамерами. Однако, для практического использования в клинических условиях, жидкий азот должен быть заменен безжидкостной системой охлаждения. В рамках настоящего проекта был спроектирован и реализован прототип криокулера Джоуля-Томпсона (ДТ), основанный на коммерчески доступной системе Kryoz BV (Нидерланды), который должен удовлетворить данную потребность. Прототип включает так называемый “холодный палец” с интерфейсом, оптимизированным для СКВИД задач, и с прозрачным окном для интеграции с микрожидкостной системой. Общая потребность только нашей страны в подобных оптимизированных тест-системах составляет сотни единиц.
Постер

Poster_IN-9675786.ppt