Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0106

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0106
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук"
Название доклада
Разработка регламента детекции и маркирования новых генов комплексной устойчивости к грибным патогенам пшеницы на основе геномного секвенирования
Докладчик
Салина Елена Артемовна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целью прикладного научного исследования является разработка молекулярных маркеров для проведения маркер-
опосредованной селекции по генам, определяющим хозяйственно-ценные признаки, и для высокопроизводительного
генотипирования культивируемых видов пшеницы. Выявление генов устойчивости к грибным заболеваниям по данным
секвенирования ВАС-клонов пшеницы из ген-обогащенных районов индивидуальных хромосом.
Основные задачи исследования включали:
• создание научно-технического задела, связанного с расшифровкой генома мягкой пшеницы, а именно, секвенирование 750 ВАС-клонов, в том числе из районой локализации генов устойчивости к грибным патогенам;
• выявление структурных и функциональных отличий аллелей идентифицированных генов, определяющих устойчивость к грибным патогенам у разных сортов и линий культивируемых видов растений;
• разработка молекулярных маркеров для проведения маркер-опосредованной селекции по генам, определяющим устойчивость к грибным патогенам, и для высокопроизводительного генотипирования культивируемых видов растений;
• разработка маркеров для тест-систем, направленных на идентификацию генов устойчивости к грибным патогенам.
Актуальность и новизна исследования
Необходимость в поиске генов, определяющих устойчивость к фитопатогенам обусловлена, прежде всего, тем, что контроль и использование взаимодействия генотип-среда является важным аспектом повышения урожайности и качества зерна пшеницы, а именно, грибные фитопатогены, такие как ржавчины, вызывают наибольшие потери урожая пшеницы, которые в неблагоприятные годы могут составлять до 70%, кроме того отдельные виды грибных фитопатогенов приводят помимо снижения урожая еще и к формированию зерна, токсичного для человека и животных. Кроме того, наблюдается изменения климатических условий в зонах выращивания пшеницы, происходит изменения расового состава грибных патогенов, наблюдается потеря устойчивости у сортов из-за увеличения численности рас патогенов, преодолевающих гены устойчивости возделываемых сортов пшеницы. В связи с этим, поиск новых генов устойчивости к грибным инфекциям и привлечение новых генов устойчивости к грибным заболеваниям в селекцию мягкой пшеницы Triticum aestivum являлось актуальной работой. Новизна работы в первую очередь связана в тем, что в процессе работы были впервые подобраны маркеры, к ген-содержащим районам хромосом, которые позволили эффективно диагностировать гены устойчивости к грибным патогенеам. Впервые получены данные по секвенированию отдельных районов 5В хромосомы, которые вошли в построение рефенсного генома мягкой пшеницы в рамках Международного консорциума по секвенированию генома пшеницы.
Описание исследования

При проведение секвенирования ВАС-клонов на платформе 454, клоны были объединены в 75 пулов по 10 ВАС-клонов в каждом. Проведено выделение ДНК, по методике, позволяющей минимизировать присутствие ненужных примесей (E. coli) в препарате ДНК.

Идентификация ВАС-клонов, обогащенных генами проводилась тремя подходами. Первый подход – метод прямой идентификации с использованием биоинформатического анализа данных секвенирования ВАС – клонов. Второй метод базировался на использовании метода RGA- профайлинга. В основе третьего подхода были использованы молекулярные маркеры, разработанные по данным секвенирования ВАС-клонов, с последующей локализацией этих маркеров/клонов на генетической карте.

В ходе работы по данным секвенрования было разработано более 200 маркеров, которые впоследствии проверялись на различных выборках растений. При разработке SSR маркеров для выявления периодичностей используется алгоритм, основанный на свойствах сложностных разложений, формирующихся  в режиме скользящего окна (Gusev et al., 2009). Этот алгоритм гарантирует обнаружение всех совершенных периодичностей в символьных последовательностях (в частности, в ДНК-последовательностях). В анализ были взяты только периодичности длиной не менее 20 символов и длиной периода от 2 до 4. Т.е. кратность повторений не менее 10 для периода 2 и не менее 5 для периода 4. Разработка праймеров к отобранным последовательностям ДНК осуществлялась с помощью программы PrimerQuest [http://eu.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index].  ISBP-праймеры (insertion site based polymorphism) подбирали для последовательностей, содержащих в себе участки, охватывающие сайты инсерции МЭ. В основе этого метода лежит предположение, что, несмотря на широкую представленность МЭ в геноме пшеницы, большинство инсерций МЭ в геномную последовательность (даже в другой МЭ) являются уникальными. Благодаря этому, ПЦР с использованием праймеров, ограничивающих точку стыка 2 МЭ, дает специфичный продукт амплицикации с известной длиной. При разработке маркеров поьзовались программой ISBP Finder. Алгоритм программы - последовательности пшеницы маскируются программой RepeatMasker, сравниваются с библиотекой мобильных элементов TREP, затем к отобранным последовательностям разрабатываются праймеры c помощью программы Primer3.

 

Результаты исследования

Выполнено секвенирование 750 ВАС-клонов. Объем прочтенных последовательностей составил не менее 20 млн. нуклеотидов на пул, что при средней длине ВАС клона около 100 тыс. нуклеотидов соответствует минимум 20 кратному покрытию. Общий объем полученных данных составил 1.5 млрд. нуклеотидов. Дополнительно были секвенированы 5 парно-концевых библиотек (каждая библиотека включала по 100 BAC-клонов), для которых было получено 2.1 млрд нуклеотидов.

Биоинформатический анализ данных позволил выявить ряд генов, ассоциированных с формированием устойчивости, такие как дефензины, кальций-зависимые протеин-киназы (CDPK), липоксигеназы и гены, содержащие домен цинкового пальца C3HC4 типа. В то же время для генов специфической устойчивости, содержащих LRR и NBS домены, были найдены только усеченные копии. Проведена апробация эффективности использования метода RGA-профайлинга для идентификации ВАС-клонов, обогащенных генами устойчивости. Показано, что разработанная модификация метода RGA-профайлинга позволяет быстро и эффективно проводить дифференциальный скрининг ВАС клонов или контигов ВАС  клонов с целью идентификации тех ВАС клонов или контигов, которые содержат гены устойчивости. Всего было выявлено 24 клона, несущих предполагаемые гены устойчивости к грибным патогенам. Были проведены работы по локализации RGA-фрагментов, с использованием картирующей популяции, с дальнейшей идентификацией дополнительного числа ВАС-клонов, обогащенных RGA-фрагментами для формирования более объективной оценки эффективности использования RGA-профайлинга для поиска ВАС-клонов, содержащих гены устойчивости к грибным заболеваниям пшеницы. Данный подход позволил дополнительно к 24 клонам, обнаружить 16 клонов, ассоциированных с генами устойчивости к грибным патогенам в субтеломерном районе короткого плеча хромосомы 5BS.

Идентифицировано более 200 SSR и ISBP маркеров, не имеющих аналогов в международной базе данных по маркерам пшеницы.  Часть полученных маркеров была проверена на выборке из замещенных/делеционных и контрастных по проявлению устойчивости линиях пшеницы. Четыре SSR маркера Xicg16c004_2, Xicg16c041, Xicg14c009, Xicg16c020 по данным тестирования на двух линиях пшеницы, контрастных по проявлению устойчивости к грибным патогенам, были отобраны как потенциальные маркеры для генов устойчивости, локализованных на коротком плече хромосомы 5В. Дополнительных 3 маркера к генам комплексной устойчивости к грибным заболеваниям, были получены при секвенировании и анализе районов локализации генов на шестой и седьмой группе хромосом.

Проведена разработка лабораторной методики генотипирования растений с использованием молекулярных маркеров для генов, определяющих комплексную устойчивость к грибным заболеваниям. В ходе разработки методики подобраны условия для ПЦР-идентификации 9 генных локусов и плейотропных генов комплексной устойчивости пшеницы к грибным заболеваниям с использованием молекулярных маркеров, в том числе разработанных в ходе работы.

Практическая значимость исследования
Получен патент №2598275 от 30.08.2016 на изобретение «Способ создания линий озимой мягкой
пшеницы с комплексной устойчивостью к грибным болезням», РФ.
Подана заявка на авторское свидетельство «Базы данных по молекулярным маркерам генов устойчивости пшеницы к болезням (Мигрэ).
Область применения результатов проекта – агробиотехнология. Практическое внедрение полученных результатов базируется
на интеграции разработанных молекулярных маркеров и идентифицированных генов устойчивости к грибным болезням в
селекцию растений. Основой подход для практического внедрения полученных результатов - маркер-опосредованный отбор.
Результаты практического внедрения будут способствовать увеличению разнообразия зерновых культур, приведут к
сокращению времени создания новых сортов, будут способствовать более рациональному использованию пахотных земель.