Регистрация / Вход
Прислать материал

14.604.21.0111

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.604.21.0111
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук
Название доклада
Получение нуклеиновых кислот с помощью трифосфатов дезоксинуклеозидов, содержащих низкомолекулярные функциональные группы на пиримидиновых основаниях.
Докладчик
Чудинов Александр Васильевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
1. Разработать методы получения ПЦР-амплифицируемых фрагментов ДНК, содержащих на гетероциклических основаниях низкомолекулярные функциональные группы, включая фрагменты аминокислот, входящих в антигенсвязывающие центры иммуноглобулинов, для создания технологических основ направленного синтеза ДНК-аптамеров, способных специфично взаимодействовать с биологическими мишенями различной природы, включая молекулы белков и нуклеиновых кислот. Увеличение разнообразия нуклеотидов для расширения областей применения модифицированных ДНК в биотехнологических исследованиях и приложениях.
2. Разработать методы получения нуклеозидтрифосфатов с функциональными группами на гетероциклических основаниях пригодных для получения аптамеров по методу SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, или Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением), а именно, быть совместимыми с ДНК-полимеразами и после включения в ДНК обладать сродством к белковой молекуле-мишени. Синтетический поиск структур производных дезоксиуридинтрифосфата, несущих по С5-положению фрагменты аминокислот, испытание на совместимых с ДНК полимеразами и пригодность для метода SELEX.
Актуальность и новизна исследования
Элементом новизны данного проекта являются синтезированные новые модифицированные трифосфаты дезоксиуридина, которые оказались совместимы не только с труднодоступной KOD XL но и с доступной Vent (exo-) ДНК-полимеразой для получения модифицированной однонитевой ДНК методом достраивания праймера и методом ПЦР. Найдены новые соединения, которые дают возможность использовать ПЦР для обогащении библиотеки модифицированных аптамеров.
Конструирование и разработка методов синтеза модифицированных нуклеозидтрифосфатов, содержащих специальные низкомолекулярные функциональные группы для взаимодействия с белковыми молекулами-мишенями представляется крайне важной и непростой задачей мирового уровня в области молекулярно-генетических исследований, требующей значительных знаний в различных областях химии и молекулярной биологии. Решение этой задачи открывает новое направление исследований с большими перспективами дальнейшего развития, как в области научных исследований, так и био-медицинских приложений.
Описание исследования

Методология проведения работ основывается на синтезе серии производных трифосфатов дезоксиуридина с системным изменении структуры, несущей функциональные группы аминокислот фенилаланина, тирозина, триптофана, валина, лейцина, изолейцина, наиболее часто входящих в антигенсвязывающие центры иммуноглобулинов. Меняется химическое строение линкера соединяющего нуклеиновое основание с функциональной группой. Для энзиматического получения ДНК с модифицированными нуклеотидами исследуются несколько наиболее перспективных ДНК-полимераз. Ферменты чрезвычайно чувствительны к структурным особенностям субстратов. Заранее предсказать наиболее эффективный способ присоединения аминокислотного фрагмента к нуклеотиду сложно. В ряду производных с неизменной функциональной группой и изменяющимся линкером можно будет найти соединения совместимые с ДНК-полимеразами. Затем среди производных с различными функциональными группами с подходящей ДНК-полимеразой методом SELEX можно будет найти те соединения, которые наиболее подходят для заданной белковой мишени. Для другой белковой мишени могут потребоваться модифицированные нуклеотиды с другими функциональными группами. Контроль эффективности и правильности получения копий модифицированной ДНК с не модифицированной и, обратного получения не модифицированных копий с модифицированной ДНК, проводится на разных моделях несколькими независимыми методами. Данный подход позволяет надеяться на эффективный выбор структур производных трифосфатов дезоксиуридина для использования в процедуре SELEX и на успешное выполнение проекта в целом.

 

Результаты исследования

1. С начала выполнения проекта синтезировано 15 (пятнадцать) новых образцов трифосфатов дезоксиуридина связанные по С5-положению с кислотами содержащими фенильные, индольные и алифатические фрагменты. Функциональная часть модифицирующих групп соответствуют фрагментам аминокислот фенилаланина, тирозина, триптофана, валина, лейцина и изолейцина часто входящих в антигенсвязывающие центры иммуноглобулинов. Для синтеза этих соединений использовалась схема, которая включает многостадийное получение 5`-трифосфата 5-аминоаллил-2`-дезоксиуридина и его ацилирование по аминогруппе гидроксисукцинимидными эфирами соответствующих кислот.Разработаны две лабораторные методики получения модифицированных трифосфатов дезоксиуридина с функциональной группой на гетероциклическом основании, с фенилуксусной и индолуксусной кислотами.Эффективность получения модифицированной ДНК с использованием синтезированных модифицированных трифосфатов дезоксиуридина исследовали методами достраивания праймера (primer extension, РЕ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР).В методе РЕ исследовали элонгацию праймера с немодифицированной и модифицированной матрицами с Taq, Deep Vent, Vent (exo-), Pfu и KOD XL ДНК-полимеразами на 40-мерной ДНК-матрице, содержащей тройные и четверные повторы А. Найдено, что все полимеразы, кроме Taq Pol, способны включать все модифицированные нуклеотиды по не модифицированной матрице с образованием полноразмерного продукта со 100% выходом. При включении не модифицированных нуклеотидов по матрице содержащей модифицированные нуклеотиды результаты различаются, как для модифицированных нуклеотидов, так и для ДНК-полимераз. Выход полноразмерных продуктов с KOD XL близок к 100% для всех модифицированных dUTP. Для Deep Vent Pol и Vent (exo-) Pol выход полноразмерных продуктов колеблется от 100% до 59% в зависимости от модификаций dUTP. Выход выше для нуклеотидов содержащих алифатические фрагменты, причем для Vent (exo-) Pol несколько выше, чем для Deep Vent Pol. Для Pfu Pol полноразмерные продукты наблюдались для нуклеотидов содержащих только алифатические фрагменты с выходом от 100% до 28%.В методе РЕ выполнена оценка степени последовательного множественного встраивания модифицированных трифосфатов в растущую цепь на 42-мерной матрице содержащей двадцатикратный повтор А. Найдено, что с Vent (exo-) Pol полноразмерные продукты можно обнаружить уже через 15 мин после начала реакции. Скорость образования полноразмерного продукта выше для нуклеотидов содержащих алифатические и индольные фрагменты. Для Taq Pol для всех нуклеотидных аналогов образование полноразмерного продукта достройки праймера не наблюдалось.Выполнена оценка получения модифицированной ДНК в ПЦР. В качестве матрицы для амплификации использовали бактериальную ДНК гена rpoB M. Tuberculosis.  Найдено, что Vent (exo-) Pol при полной замене природного dTTP на модифицированный dUTP корректно встраивает в ДНК модифицированные нуклеотиды, содержащие алифатические фрагменты с сохранение исходной последовательности (первичной структуры) матрицы в получаемом ампликоне.2. Планируется изготовить экспериментальную партию наиболее эффективного дезоксинуклеозидтрифосфата с функциональной группой на гетероциклическом основании и провести его расширенные испытания для получения модифицированных ДНК и оптимизировать методику получения модифицированных ДНК в ходе ПЦР.

Практическая значимость исследования
1. Дезоксинуклеозидтрифосфаты с низкомолекулярными функционально-значимыми группами на пиримидиновых основаниях, будут использоваться, прежде всего, в организациях, ведущих исследования, по созданию модифицированных ДНК-аптамеров (сомамеров) с целью создания высокотехнологичного производства препаратов, способных специфично взаимодействовать с биологическими мишенями различной природы, включая молекулы белков и функционально значимых низкомолекулярных соединений.
2. Положительные результаты ПНИ в части применения новых трифосфатов дезоксинуклеозидов, содержащих низкомолекулярные функциональные группы на пиримидиновых основаниях, потребуют в дальнейшем разработки технологии их масштабного получения, аттестации и сертификации в соответствии с законодательством РФ. Эта работа будет выполняться индустриальным партнером ООО БИОЧИП-ИМБ, подписавшим соответствующее соглашение и заинтересованным в будущем производстве и распространении трифосфатов дезоксинуклеозидов, содержащих низкомолекулярные функциональные группы на пиримидиновых основаниях. Эти соединения будут производиться в России впервые, и в их использовании будут заинтересованы организации, занимающиеся разработкой модифицированных ДНК-аптамеров (сомамеров) с целью создания высокотехнологичного производства препаратов, способных специфично взаимодействовать с биологическими мишенями различной природы, включая молекулы белков и нуклеиновых кислот.
3. Использование результатов проекта в работах связанных с получением модифицированных ДНК-аптамеров, заменяющих по некоторым свойствам антитела, позволит получить панели аптамеров к ряду значимых белков, расширит протеомные исследования практической медицинской направленности, и в конечном итоге приведет к снижению риска смертности и повышению качества жизни. Результаты проблемно-ориентированных научных исследований по разработке методов получения фрагментов модифицированных ДНК, повысят конкурентные позиции отечественных производителей продукции медицинского назначения. В конечном итоге будут снижены импортные закупки высокотехнологичных диагностических тест-систем и комплектующих материалов.