Регистрация / Вход
Прислать материал

14.587.21.0011

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.587.21.0011
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (государственный университет)"
Название доклада
Новые светоуправляемые каналы и транспортеры для оптогенетического контроля нейронов и исследований мозга
Докладчик
Рогачев Андрей Вячеславович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Объект исследования – светочувствительные ретиналь-связывающие белки, являющиеся базовыми инструментами оптогенетики.
Основной целью проекта является выявление и создание новых светочувствительных ретинальных мембранных белков со свойствами, необходимыми для оптогенетического контроля нервных клеток.
Для достижения основной цели проекта будет выполнена работа по следующим задачам:
а) рациональный скрининг базы данных аминокислотных последовательностей при поддержке компьютерного моделирования для выявления перспективных кандидатов новых светочувствительных протонных и ионных каналов и насосов, которые представляют потенциальный интерес для неврологии (IBS и МФТИ);
б) генная инженерия, экспрессия и очистка белков из предложенных белков-кандидатов (ICS-6);
в) функциональная характеризация в пробирке методами спектроскопии, в том числе определение фотоцикла методами флэш-фотолиза и спектроскопии одиночных молекул (МФТИ);
г) крупномасштабное производство белков-кандидатов, выбранных на этапах 2 и 3 для изучения структуры (МФТИ);
д) кристаллизация и решение структуры для выбранных белков (IBS);
е) основанное на знаниях о структуре и свойствах, компьютерное моделирование новых белков с нужными свойствами (калиевых насосов, натриевых и калиевых ионных каналов) на основе ретинальных белков, в частности тех, структуры которых мы недавно решили (IBS, МФТИ);
ж) функциональная характеристика вновь созданных светочувствительных белков в естественных условиях, включая их активность в нервных клетках (MPI).
Актуальность и новизна исследования
В 2010 году оптогенетика была выбрана методом года среди всех областей науки и инженерии по версии междисциплинарного научного журнала Nature Methods. В том же году оптогенетика была охарактеризована в статье как «прорыв десятилетия» в научно-исследовательском журнале Science.
Медицинские применения оптогенетики для лечения таких тяжелых заболеваний и расстройств (как, например, болезнь Паркинсона, эпилепсия, наркотическая зависимость, депрессия, нарушение сна, боль и шизофрения) активно и углубленно разрабатываются в настоящее время.
Таким образом, нейронная оптогенетика сдвигается из области фундаментальной академической науки в сторону развития высокоэффективных методов вмешательства в мозговую деятельность и исправления определенных патологических процессов. В нейронных цепях информация передается по нейронам в форме потенциала действия, возникающего из-за разности электрических потенциалов между внешней и внутренней сторонами цитоплазматической мембраны нейрона. Ионные каналы, транспортеры и рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), встроенные в мембрану нейрона, функционируют как молекулярные машины, создающие, регулирующие и модулирующие потенциал действия. Оптогенетика позволяет модифицировать часть этой молекулярной машинерии или вводить новые чужеродные световозбудимые белки, такие как определенные ретиналь-связывающие белки микроорганизмов, в мембрану нейронов с целью возможности манипулирования нейронными циклами при помощи оптических методов. Несмотря на выдающиеся достижения в области оптогенетики, в ней еще остается множество нерешенных задач, в том числе поиск новых оптогенетических инструментов для управления активностью нейронов.
Описание исследования

В ходе реализации проекта выполняется поиск и создание новых светочувствительных каналов и транспортеров, используя два взаимодополняющих подхода: а) идентификация новых белков или определенных мутантных белков с помощью анализа эволюции родопсинов из разных видов и типов; б) молекулярно-динамическое моделирование процессов проникновения и транспорта, происходящих в светочувствительных каналах и транспортерах с известной кристаллической структурой для того, чтобы получить более глубокое понимание механизмов, лежащих в основе ионного транспорта и для системного прогнозирования мутаций на рациональной основе.

Объединение этих стратегий приведет к успешной функциональной экспрессии для многих новых родопсинов, которые в дальнейшем будутсозданы и изучены в рамках проекта.

Наши эксперименты будут определять светочувствительные белки, которые встраиваются во внутриклеточные органеллы, такие как эндосомы / лизосомы или эндоплазматический ретикулум, и могут быть полезными для оптогенетических подходов контроля выделения Ca2+ из внутриклеточных органелл или изменения лизосомальной активности.

Имеющиеся структуры основных состояний не являются достаточными для выявления тонких молекулярных деталей ионной проводимости и селективности. Знание этих деталей необходимо для разработки стратегий по изменению селективности и требует определение структур родопсинов в промежуточных состояниях. Наша цель здесь заключается в определении структуры высокого разрешения для промежуточных состояний К+ и Na+ насосов, а также ChR2 с помощью рентгеновской кристаллографии.

 

Результаты исследования

На первом этапе работ выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, показано, что в ряде современных публикаций отражены результаты поиска новых и модификацию классических оптогенетических инструментов, выявлены основные фокусы исследований. По результатам рационального скрининга базы данных аминокислотных последовательностей, а также с учетом данных иностранного партнера Institut de Biologie Structurale, (IBS, Франция) по анализу классов сенсорных и канальных родопсинов, при поддержке компьютерного моделирования, были идентифицированы консервативные аминокислотные остатки в определенных позициях и выполнен анализ протонных помп, хлорных и натриевых насосов насосов. Это позволило выявить перспективных кандидатов новых светочувствительных протонных и ионных каналов и насосов, представляющих потенциальный интерес для оптогенетики (определены потенциальные целевые белки):

а) Родопсин MacR из Candidatus Actinomarina minuta, представитель кластера RDTEDK. Предположительно протонный насос. Важнейшей отличительной особенностью белка является его крайне малый размер и крайне малый размер организма, в котором белок обнаружен. Найден при анализе важных деталей существующего кластера.

б) Ксенородопсин XeR из Candidatus Nanosalina, представитель кластера WDSAPK. Кластер был найден при дальнейшем филогенетическом анализе базы данных белков. Отличительной особенностью кластера является практически полное несовпадение ключевых консервативных аминокислот с «классическими» (например, замена аргинина на триптофан).

в) Белки, находящиеся в стадии подбора и оптимизации генетических конструкций для экспрессии. Работы ведутся иностранным партнером:

1) Безлизиновый родопсин (Q-Rh) из кластера RNTNDQ из организма Penicillium digitatum;

2) Натриево-протонные гибридные светочувствительные насосы (NaR) из Gillisia limnaea, из Truepera radiovictrix и из Nonlabens marinus S1-08;

3) Предполагаемые сенсоры из Candidatus Haloredivivus, С117 по результатам метагеномного секвенирования и из семейства Acidibacterium (B1-BR-g2).

На втором этапе реализации проекта с двумя отобранными кандидатами, родопсином MacR и ксенородопсином XeR, проведены спектроскопические и функциональные исследования. Партнерской организацией, Institute of Complex Systems-6: Structural Biochemistry, Research Center Juelich (ICS-6), Германия, проводится предварительная работа с прочими перспективными кандидатами.

По результатам обзора и анализа существующей литературы по спектроскопической и функциональной характеризации фотоактивируемых каналов и транспортеров обоснованы подходы и методики, позволяющие решить поставленные задачи и достичь заданных параметров по точности.

Проведены спектроскопические исследования препаратов белков родопсина MacR и ксенородопсина XeR в солюбилизированном виде и реконструированными в нанодиски. Исследованы свето- и темно-адаптация белков. Результаты дополнены зависимостью спектра поглощения от pH буфера, в котором находился белок.

Предложенные экспериментальные подходы к характеризации фотоактивируемых каналов и транспортеров белковых препаратов позволяют дать качественный ответ о функциональной активности целевых белков.

Иностранным партнером проведена сборка генетических конструкций и функциональная экспрессия в Escherichia coli дополнительных белков-кандидатов.

Практическая значимость исследования
В области методик оптогенетического контроля и их использования в нейробиологии ниша высокопроизводительных систем для рационального конструирования фотоактивируемых мембранных белков не заполнена, что приводит к дефициту эффективных инструментов.
Исходя из тенденций развития оптогенетики можно предполагать, что привлечение в качестве дополнительных оптогенетических инструментов селективных катионных насосов представляет значительный практический интерес.
Непосредственные результаты проекта найдут применение в фундаментальных исследованиях нейробиологии, а также создадут основу для медицинских применений. Сопутствующие наработки будут иметь самостоятельную важность для развития ряда научных областей затронутых в проекте: будут разработаны биоинформатические методы поиска белков с заданными характеристиками; методы экспрессии ряда мембранных белков; подходы к получению переходных состояний белков (в том числе с использованием рентгеновских лазеров на свободных электронах); методы кристаллизации мембранных белков; методы компьютерного моделирования новых белков с нужными свойствами. Проект также является значимым для развития оптогенетических исследований и их приложений, которые требуют создания панели светоактивируемых белков с различными функциями как инструментов тонкой настройки нейронных процессов. Настоящий проект будет способствовать этому развитию, предоставляя светочувствительные транспортеры и каналы с новыми, крайне необходимыми свойствами. Результаты проекта создадут рациональную парадигму для исследований и инженерии таких оптогенетических инструментов.