Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0060

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0060
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"
Название доклада
Получение бифункциональных терапевтических антител для профилактики вирусных заболеваний при мукозальном применении
Докладчик
Кирпичников Михаил Петрович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель проекта - создание эффективного, доступного и безопасного средства профилактики инфекции различными серотипами вируса гриппа А на основе бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител к гемагглютинину, обеспечивающих направленную активацию системы врожденного иммунитета слизистых оболочек человека.

Основные задачи проекта
1) конструирование системы экспрессии бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител различного биоинженерного формата;
2) получение клеточных линий-продуцентов и экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител;
3) проведение иммунохимического анализа IgG/IgA-гибридных антител с использованием различных подтипов вируса гриппа А;
4) проведение исследований биологических свойств IgG/IgA-гибридных антител на клеточных моделях in vitro;
5) проведение биологических испытаний и определение терапевтической эффективности IgG/IgA-гибридных антител на животных, летально инфицированных различными изотипами вируса гриппа А.

Актуальность и новизна исследования
Для вируса гриппа А известно 16 подтипов, каждый из которого отличается значительной изменчивостью капсидных белков гемагглютинина и нейираминидазы. Изменение структуры вирусных белков в результате мутаций значительно осложняет создание универсальных терапевтических средств для борыбы с инфекцией. Получение иммунной сыворотки, обладающей широкой специфичностью в отношении различных подтипов вируса гриппа А (ВГА), в течение многих лет является одной из наиболее приоритетных задач современной фармакологии. Проект направлен на получение биотехнологическим способом препарата рекомбинантных антител, способных оказывать профилактический и лечебный эффект в отношении всех подтипов гриппа А. Отличительной особенностью данного проекта является получение и разработка средств мукозальной профилактики и лечения гриппозной инфекции на основе IgG/IgA – гибридных терапевтических антител. Использование для создания терапевтического средства константного домена IgA-подкласса должно активировать широкий набор антитело-опосредованных эффекторных функций. Предлагаемое терапевтическое антитело является полностью человеческим и характеризуется или полным отсутствием или чрезвычайно низкой иммуногенностью, что повысит эффективность терапевтического воздействия. По сравнению с известными препаратами для лечения гриппа предлагаемое лекарственное средство должно характеризоваться минимумом побочных эффектов и не обладать токсичностью, что делает его особенно востребованным для профилактики заражения гриппом у детей, беременных женщин, пациентов с ослабленной иммунной системой.
Описание исследования

В качестве молекулярных форматов бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител были решено осуществить получение 4-х изоформ: мономеров IgA1 и IgA2m1-изотипов и димеров соответствующих изотипов. Также в качестве образца сравнения планировалось получение антитела IgG1-изотипа, содержащее аналогичные вариабельные домены.

Для этого осуществлены биосинтез и клонирование константных доменов тяжелой цепи иммуноглобулина А IgA1 и IgA2m1-изотипов, а также J-цепи. Проведена сборка генов бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител, адаптированных для эукариотической экспрессии. Получены оптимальные системы экспрессии мономерных форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител двух изотипов, а также J-цепи. Для получения IgG/IgA-гибридных антител IgA1 и IgA2m1-изотипов получены двухвекторная и бипромоторная (обе цепи антитела в одной плазмиде) система экспрессии. Сравнительный анализ уровня продукции антител после трансфекции и проведения первичной селекции продемонстрировал преимущество бипромоторной системы экспрессии.

Получены клеточные линии СНО-продуценты мономерных форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител IgA1 и IgA2m1-изотипов. Для отбора клонов-продуцентов была использована технология отбора, основанная на последовательном повторяющемся использовании селективного давления метотрексатом, флуоресцентного клеточного сортинга и роботизированной системы высокоточного отбора клонов-суперпродуцентов Clone PIX FL. Отобранные клоны-продуценты были исследованы на жизнеспособность и продуктивность при культивировании в жидкой среде. Для увеличения выхода рекомбинантных антител была проведена адаптация клонов-продуцентов к условиям выращивания в суспензии в бессывороточной среде. Проведена наработка, выделение и очистка 4-х бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител, а также антител IgG1-изотипа.

На основе Клеточных линий СНО - продуцентов мономеров IgA в результате дополнительной трансфекции экспрессионной плазмидой, содержащей J-цепь, получены продуценты димерных форм бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител IgA1 и IgA2m1-изотипов. Проведена работа по оптимизации процесса биосинтеза с целью увеличения выхода бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител.

Проведено иммунохимическое исследование взаимодействия бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител с штаммами вируса гриппа А H1N1- и H3N2- подтипов. Проведенный иммунохимический анализ  в отношении различных серотипов ВГА свидетельствует о том, что все образцы распознают все 10 реликтовых и актуальных штаммов ВГА в непрямом ИФА, имеют аффинность, выраженную значением константы диссоциации компекса антиген-антитело, не выше 4 нМ и направлены против консервативного эпитопа, расположенного на молекулах гемагглютинина HA0 и НА1. Аффинность исследованных образцов по отношению к штаммам серотипа H1N1 выше, чем по отношению к штаммам серотипа H3N2.

Экспериментальные исследования биологических свойств  бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител в экспериментах in vitro проводили на штаммах A/Aichi/2/68 (H3N2), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2), A/Anhui/1/13 (H7N2) и др. Бифункциональные антитела ингибировали разные штаммы вируса гриппа в разной степени. Наиболее чувствительными к ним оказались вирусы A/mallard/Pennsylvania/10218/84 (H5N2) и A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Для них значения IC50 антител IgG1 составили 0,1 мкг/мл, снижение титра вируса – 4 порядка, а индексы селективности –1000; IC50 антител IgА1 составили 0,1 и 0,5 мкг/мл, а индексы селективности –1000 и 200 соответственно, что характерно для препаратов с высокой противовирусной активностью.

Проведены испытания эффективности интраназального введения бифункциональных IgG/IgA – гибридных антител на мышиных моделях гриппозной пневмонии в сравнении с внутрибрюшинной формой введения и контрольными антителами.Показано, что бифункциональные антитела, а также антитела IgG-изотипа проявляют протективный эффект при профилактическом интраназальном и в меньшей степени при профилактическом внутрибрюшинном введении. Интраназальное введение антител IgA-изотипа наиболее эффективно в сравнении с другими антителами и другими формами введения у мышей, зараженных A/California/07/09 (H1N1)pdm09, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2). При этом вплоть до 7-8 дня после заражения выживаемость животных, получивших интраназальную профилактику, идентична или превышает соответствующий параметр для контрольного препарата Тамифлю, что подтверждает значительный терапевтический потенциал полученных рекомбинантных антител.

 

 

 

 

Результаты исследования

1. Разработаны генетические конструкции для экспрессии бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител различного биоинженерного формата (мономерные и димерные формы человеческого иммуноглобулина А).

2. Созданы клеточные линии СНО - продуценты бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител различного биоинженерного формата.Получены 4 линии СНО – продуценты мономеров и димеров IgA1 и IgA2, а также продуцент контрольных антител IgG-изотипа

3. Проведена оптимизация биосинтеза, разработаны эффективные методы выделения и очистки бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител. Установлено, что клетки СНО, продуцирующие димерные формы бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител обладают более высокой продуктивностью и жизнепособностью.

4. Наработаны 4 экспериментальных образца бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител, проведен их биохимический и иммунохимический анализ.

5. Проведены биологические испытания эффективности и безопасности экспериментальных образцов бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител на модельных животных, летально инфицированных различными коллекционными штаммами вируса гриппа А.

6. В экспериментах in vitro бифункциональные антитела ингибировали разные штаммы вируса гриппа, снижение титра вируса составляет 4 порядка.

7. Интраназальное введение антител IgA-изотипа наиболее эффективно в сравнении с другими антителами и другими формами введения у мышей, зараженных A/California/07/09 (H1N1)pdm09, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и A/Aichi/2/68 (H3N2). При этом вплоть до 7-8 дня после заражения выживаемость животных, получивших интраназальную профилактику, идентична или превышает соответствующий параметр для контрольного препарата Тамифлю.

Полученные результаты свидетельствуют о достижении поставленной цели и выполнении задач проекта. Подтверждена эффективность полученных образцов бифункциональных IgG/IgA-гибридных антител при интраназальном профилактическом применении у мышей, летально инфицированных 50-кратной дозой вирусов гриппа различных подтипов. Функциональные свойства разработанных рекомбинантных антител открывают значительные перспективы коммерциализации полученных результатов прикладных научных исследований. 

Практическая значимость исследования
Иммунопрепарат на основе бифункциональных IgG/IgA- гибридных антител широкой специфичности в отношении серотипов вируса гриппа А может быть рекомендован для специфической профилактики пациентов групп риска (дети, пожилые люди, беременные женщины, люди с ослабленной иммунной системой), а также для профилактики и лечения населения в целом. Разработка препарата уменьшит затраты системы здравоохранения на получение сезонных вакцин и борьбу с возможными пандемиями.

Новый препарат будет незаменим для тех категорий граждан, которым вакцинация противопоказана или не рекомендуется. В данном случае распространение препарата нужно развивать через учреждения с государственным участием (больницы, дошкольные и школьные учреждения). Предлагаемый продукт в первую очередь может практически полностью заменить на рынке препарат на основе действующего вещества J05AH01 Занамивир (ТН Реленза), характеризующегося высокой эффективностью, но наличием побочных эффектов. Новый препарат на 30% готов заменить, представленные на рынке в широком ассортиментном диапазоне препараты на основе устаревшего действующего вещества J05AC02 Римантадин. В первый же год начала с реализации новый препарат сможет занять не менее 20 % доли рынка неселективных противовирусных препаратов с Торговыми марками Кагоцел, Арбидол, Ингавирин. Также в потенциале препарат может претендовать на 30% рынка гомеопатических препаратов с недоказанной эффективностью - Оциллококцинум и Анаферон.