Регистрация / Вход
Прислать материал

14.616.21.0066

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.616.21.0066
Тематическое направление
Индустрия наносистем
Исполнитель проекта
Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук"
Название доклада
Использование возможностей Европейского Центра Синхротронного Излучения для исследования пространственной организации архитектурных белков D.melanogaster и их комплексов. На примере ZAD-домена транскрипционного активатора Serendipity-D.
Докладчик
Бойко Константин Михайлович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целью исследования является изучение пространственной организации архитектурных белков (и/или их доменов), а также их функциональных комплексов, контролирующих архитектуру генома и обеспечивающих регуляцию экспрессии генов у дрозофилы D.melanogaster.
Для реализации проекта планируется решить следующие основные задачи:
1. Получить отобранные белки в количествах и с чистотой, достаточной для проведения структурных исследований методом рентгеноструктурного анализа. Данная задача будет решена с использованием различных методик жидкостной хроматографии (металло-хелатная, ионная, гель-фильтрационная и др.).
2. Определить условия кристаллизации полученных белковых объектов (и/или их функциональных доменов). Для этой цели для каждого полученного объекта планируется провести широкий скрининг условий кристаллизации с использованием роботизированной системы кристаллизации.
3. Получить пространственные структуры отобранных белковых объектов (и/или их функциональных доменов) и их комплексов. Для этой цели планируется использовать два взаимно дополняющие друг друга метода рентгеноструктурного анализа и малоуглового рентгеновского рассеяния. Эксперименты будут проведены с привлечением возможностей синхротронных источников НИЦ «Курчатовский институт» и Европейского центра синхротронного излучения.
Актуальность и новизна исследования
Актуальность настоящего проекта определяется тем, что в последнее время интерес многих исследователей привлечен к изучению транскрипционных факторов, которые играют ключевую роль в регуляции транскрипции. Последние данные о трехмерной структуре хромосом и ее роли в регуляции экспрессии генов позволило выявить некоторые транскрипционные факторы, организующие пространственную структуру хромосом. У млекопитающих, в том числе и у человека, на сегодняшний день найден только один ДНК-связывающий белок - CTCF, участвующий в формировании трехмерной структуры хромосом. У дрозофилы – модельного объекта для исследования, найдено несколько инсуляторных белков, которые способны поддерживать трехмерную структуру хромосом. В то же время об особенностях пространственной структуры таких белков известно очень мало.
Научная новизна предлагаемого проекта определяется практически полным отсутствием структурных данных об архитектурных белках, участвующих в процессах установления и поддержания трехмерной структуры хромосом. Так в международном банке данных пространственных структур (www.rcsb.org) есть лишь одна структура ZAD-домена транскрипционного фактора Grauzone, (код PDB – 1PZW), несколько структур ВТВ-доменов, а также несколько структур доменов типа «цинковые пальцы», которые являются основным ДНК-связывающим доменом инсуляторных белков. При этом ряд таких белков (и/или их доменов), например, упомянутый N-концевой домен CTCF, отвечающий за димеризацию, вообще не имеют значимой гомологии с белками с установленной пространственной структурой.
Описание исследования

Пространственная организация генома играет важную роль в процессах клеточной дифференцировки и регуляции активности генома. В процессе регуляции транскрипции у эукариот участвуют элементы генома, расположенные на значительном расстоянии друг от друга. По современным представлениям существует особый класс белков, в числе которых и известные инсуляторные белки (инсулятор – геномный элемент, участвующий в функциональном разобщении хроматиновых доменов), которые участвуют в формировании и поддержании пространственной структуры хромосом, а также в контроле локальных энхансер-промоторных взаимодействий. По всей видимости, данные белки участвуют в установлении дистанционных взаимодействий между удаленными геномными элементами (более 1 тысячи пар нуклеотидов), а также привлекают мультибелковые комплексы, которые изменяют статус окружающего хроматина, однако структурно-функциональные аспекты механизмов работы архитектурных белков очень слабо изучены. Способность архитектурных белков поддерживать взаимодействие между сайтами связывания, расположенными на большом расстоянии, с одной стороны, делает возможным специфичное и эффективное сближение удаленных регуляторных элементов генома, а с другой - позволяет функционально разобщать хроматиновые домены за счет образования хромосомальных петель. Следует отметить, что основная часть информации о транскрипционных факторах, принимающих участие в дальних взаимодействиях геномных элементов, была получена в исследованиях инсуляторов из Drosophila melanogaster, что обусловлено, в первую очередь, удобством работы с модельными системами. У дрозофилы идентифицировано несколько архитектурных белков, поддерживающих пространственную структуру хромосом: CTCF, Su(Hw), BEAF-32, Pita, ZIPIC – это белки, связывающиеся с инсуляторами – геномными элементами, участвующими в разобщении хроматиновых доменов для обеспечения независимой регуляции экспрессии генов. Также инсуляторные белки, возможно, принимают участие в формировании границ топологически ассоциированных доменов.

В последнее время значительный интерес в этой области прикован к белкам, содержащим в своем составе т.н. ZAD-домены (Zink-finger associated domain - домен, ассоциированный с цинковыми пальцами). Показано, что эти домены способы формировать стабильные димеры. Многие из белков, содержащих ZAD-домены, играют важную роль в регуляции транскрипции генов, однако механизмы их функционирования неизвестны, а структурные данные практически отсутствуют. Поэтому изучение структуры этих доменов представляется актуальным, особенно в свете предположения о том, что для поддержания специфичных межбелковых взаимодействий инсуляторные белки должны содержать в своем составе димеризующие домены. Одним из инсуляторных белков дрозофилы, содержащих ZAD-домен, является транскрипционный активатор Serendipity-D.

Для установления пространственной структуры генетическая конструкция, включающая N-концевой полигистидиновый хвост, тиоредоксин, сайт расщепления TEV протеазой и собственно ZAD-домен белка Serendipity-D (104 аминокислоты) был клонирован и экспрессирован в бактериальной системе E.coli. В процессе выделения целевого белка на металлохелатной колонке от него при помощи TEV-протеазы был отщеплен тиоредоксин. На финальной стадии очистки была проведена гель-фильтрация. Широкий скрининг условий кристаллизации, проведенный на роботизированной системе Ригаку, позволил получить несколько близких условий, в которых наблюдался рост одиночных кристаллов. Последующая оптимизация найденных условий позволила получить кристаллы хорошей морфологии и размерами порядка 300х300х300 мкм, пригодные для рентгеноструктурного анализа. Рентгеноструктурный эксперимент проводился на станции ID29 синхротронного источника ESRF (Гренобль, Франция). 

Результаты исследования

По результатам первого рентгеноструктурного эксперимента и последующей обработки полученных дифрационных наборов были получены данные с разрешением 3.0Å. Тем не менее решить структуру белка по полученным данным методом молекулярного замещения (с использованием гомологичной структуры ZAD-домена транскрипционного активатора Grauzone) не удалось.

Для преодаления возникшей проблемы была проведена повторная съемка кристаллов белка методом многоволновой аномальной дисперсии (MAD), с использованием в качестве аномального рассеивателя атомы цинка, связанные в структуре белка. По полученным данным структура белка была разрешена с разрешением 3.0Å. В независимой части кристалла находится димер белка, что подтверждает данные о его способности к димеризации в растворе. Кристаллографическое уточнение структуры еще не закончено, но уже сейчас можно сказать, что структура ZAD-домена белка Sependipity-d существенно отличается от единственной известной к настоящему моменту структуры ZAD-домена транскрипционного активатора Grauzone.

Таким образом, нами получены результаты, превышающие мировой уровень в данной области.

Практическая значимость исследования
Результаты носят фундаментальный характер. Тем не менее, помимо фундаментальной составляющей, исследования имеют и прикладное значение. Так, известно, что нарушения, происходящие на уровне архитектуры хромосом, часто напрямую связаны с патогенезом многих заболеваний человека. Полученные в результате выполнения проекта структурные данные позволят в дальнейшем глубже исследовать механизмы протекания заболеваний, связанных с такими нарушениями архитектуры хромосом как, например, онкогенные хромосомные перестройки.
Постер

Poster_template_IN.ppt