Регистрация / Вход
Прислать материал

14.616.21.0061

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.616.21.0061
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук"
Название доклада
Иммунофлуоресцентные методы контроля ветеринарных препаратов и их метаболитов: результаты российско-итальянского проекта
Докладчик
Дзантиев Борис Борисович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель выполнения проекта – разработать и апробировать новые иммуноаналитические системы для мониторинга в пищевой продукции бета-агонистов и бактериостатических ветеринарных препаратов. В результате проведенных исследований разработаны новые методические решения, которые на основании использования новых флуоресцентных маркеров и форматов анализа обеспечивают снижение пределов детекции токсичных контаминант по сравнению с существующими методами и позволяют проводить экспрессное тестирование пищевых продуктов растительного и животного происхождения.
Исходя из поставленной цели, работы по проекту включали решение следующих задач:
- синтез и характеристика иммунореагентов,
- характеристика преимуществ новых флуоресцентных маркеров и форматов анализа;
- выбор и обоснование оптимальных сочетаний реагентов для высокочувствительного анализа,
- апробация разработанных методов для контроля контаминации пищевой продукции,
- сравнение разработанных и существующих аналитических методов,
- подготовка рекомендаций по практическому применению разработанных методов.
Актуальность и новизна исследования
Среди разнообразных методов, используемых для контроля контаминант пищевой продукции, особый интерес представляют гомогенные методы иммуноанализа с флуоресцентными маркерами, в которых формирование детектируемых комплексов не связано с диффузионно-зависимыми и многостадийными процессами, а результаты тестирования могут регистрироваться непосредственно в момент комплексообразования. Однако на сегодняшний день практическое применение иммунофлуоресцентного анализа ограничивается медицинской диагностикой. Основной причиной отставания средств контроля экологической и пищевой безопасности являлось отсутствие портативных и достаточно точных детекторов, а также компактных средств обработки данных. Кроме того, влияние различных матриксов, в которых должен проводиться контроль пищевых токсикантов, на регистрируемую флуоресценцию не было в достаточной мере охарактеризовано.
В последние годы произошло существенное расширение ряда флуоресцентных аналитических маркеров, а также появились коммерчески доступные портативные детекторы флуоресценции и поляризации флуоресценции. Эти изменения делают возможной, с одной стороны, адаптацию методов под особенности тех или иных контролируемых продуктов (исключение влияния матриксов), а с другой – проведение тестирования не в специализированных лабораториях, а непосредственно в местах отбора проб. Поэтому разработка, апробация и оценка конкурентного потенциала современных иммунофлуоресцентных аналитических методов становятся крайне востребованными.
Описание исследования

Разработка новых иммунофлуоресцентных аналитических систем имеет важное значение для всего круга контролируемых токсичных контаминант продуктов питания – пестицидов, микотоксинов, ветеринарных препаратов, фосфор- и хлороорганических техногенных загрязнителей и др. Однако в рамках проекта изучение новых подходов, создание и апробация прототипных аналитических систем проводилось на примерах двух групп соединений – бета-агонисты и бактериостатические ветеринарные препараты. Выбор данных объектов связан с недостаточной проработкой вопросов их иммунодетекции, начатой лишь в последние годы и требующей формирования как реагентной базы, так и новых методических решений.

Реализуемый в работе принцип поляризационного иммунофлуоресцентного анализа основан на конкурентном взаимодействии специфических антител с антигеном (аналитом), содержащимся в пробе, и конъюгатом антиген-флуорофор. Возбуждение флуоресценции плоскополяризованным светом и ее регистрация в плоскостях, параллельной и перпендикулярной плоскости возбуждения, делают возможной оценку доли флуорофора, включенного в состав комплекса с антителом и вследствие этого не способного (в отличие от свободного флуорофора) деполяризовать излучаемый свет. Данный анализ не требует предварительных инкубаций, разделения реагентов, дополнительных действий по обеспечению развития аналитического сигнала. Взаимодействие антиген-антитело регистрируется в режиме реального времени; благодаря гомогенности аналитических реакций содержание аналита в пробе можно оценить уже через 2-3 минуты после ее добавления к иммунореагентам.

Для разработки иммуноаналитических систем были охарактеризованы рецепторные биомолекулы, маркеры и их конъюгатов. Для характеристики аффинности препаратов немодифицированных антител против бета-агонистов и бактериостатиков, применяемых в разработанных аналитических системах, были использованы методы иммуноферментного анализа и поверхностного плазмонного резонанса.

Конъюгирование флуоресцентных маркеров с антигенами проводили по аминогруппе антигена (прямой синтез), по карбоксильной группе методом активированных эфиров, по гидроксильной группе с окислением периодатом натрия. Оптические свойства конъюгатов были охарактеризованы методами флуоресцентной спектроскопии.

Разработка иммуноаналитических систем была основана на выборе концентраций антител и конъюгатов маркер-антиген, состава реакционной среды, типа и концентрации дополнительных компонентов (например, детергентов), обеспечивающих достижение минимального предела обнаружения и возможность достоверного количественного (среднее отклонение результатов измерений в серии экспериментов – не более 10%) измерения содержания аналитов.

Результаты исследования

В результате выполнения проекта разработаны и охарактеризованы экспериментальные образцы тест-систем, основанных на гомогенном иммунохимическом взаимодействии компонентов и применении флуоресцентных маркеров и предназначенных для контроля качества и безопасности пищевых продуктов растительного и животного происхождения. Тест-системы обеспечивают достоверное выявление в пробах бета-агонистов (кленбутерол, рактопамин, сальбутамол и др.) и бактериостатиков (хлорамфеникол, линкомицин, тетрациклин и др.) в концентрациях от 10 нг/мл при длительности анализа 10 минут.

В ходе разработки тест-систем охарактеризована аффинность препаратов антител против бактериостатиков и бета-агонистов. Проведена оценка кинетических и равновесных параметров взаимодействий между иммунореагентами. Охарактеризована селективность используемых в анализе антител по отношению к различным бактериостатикам и бета-агонистам, продуктам их модификации и частичной деструкции. Изучено влияние матриксов проб тестируемых пищевых продуктов на эффективность проведения иммуноаналитических реакций. Для реализуемых форматов иммунофлуоресцентного анализа и используемых флуорофоров проведена теоретическая оценка потенциально достигаемых с их помощью пределов детекции низкомолекулярных аналитов. Экспериментально установлены оптимальные режимы проведения поляризационного иммунофлуоресцентного анализа, обеспечивающие минимальные пределы детекции целевых аналитов. Проведена характеристика точности и воспроизводимости результатов измерений содержания бета-агонистов и бактериостатиков разработанными методами. Показана стабильность тест-систем при разных режимах хранения.

Проведено сравнение результатов тестирования разработанными тест-системами и традиционными методами. Показана возможность использования предложенных форматов анализа с использованием новых флуоресцентных маркеров для детекции пестицидов.

Взаимодействие участников международного проекта – Центра биотехнологии РАН и Института наук о пищевых производствах (г. Бари, Италия) – включало обмен реагентами, согласование протоколов экспериментов, формирование совместной панели биопроб для валидации разрабатываемых иммуноаналитических методов, характеристику контаминации биопроб референтными хроматографическими методами. Кроме того, сторонами осуществлялся обмен специалистами для проведения совместных экспериментов, освоения новых методов, обсуждения результатов исследования и перспектив применения совместных разработок.

Эффективность разработанных тест-систем подтверждена результатами совместных испытаний, проведенных на репрезентативных выборках проб пищевых продуктов растительного и животного происхождения. Тест-системы позволяют контролировать содержание бактериостатиков и бета-агонистов в пищевой продукции в соответствии с их максимально допустимыми уровнями, установленными законодательствами Российской Федерации, Таможенного Союза и Европейского Союза.

Практическая значимость исследования
Результаты исследования показали конкурентные преимущества разработанных тест-систем и метода поляризационного флуоресцентного иммуноанализа в целом как средства экспрессного контроля токсичных контаминант пищевой продукции. Методическая простота, производительность, экспрессность и чувствительность тестирования позволяют рекомендовать его для широкого скринингового контроля в цепочках производства и распространения продуктов питания – от приемки сырья до розничной торговли. Наборы для анализа состоят лишь из предварительно подготовленной производителем и хранящейся в течение длительного времени смеси реагентов, к которой остается только добавить тестируемую пробу. Появление коммерчески доступных портативных детекторов, регистрирующих поляризацию флуоресценции, делает возможным организацию массового тестирования разрабатываемыми методами.
Совместные испытания тест-систем в рамках взаимодействия с Институтом наук о пищевых производствах – ведущей итальянской исследовательской организацией в области пищевой безопасности – подтвердили востребованность разрабатываемых методов на международном уровне и перспективы их внедрения в практику как гармонизируемых методов контроля, применяемых в том числе для экспортируемой/импортируемой пищевой продукции.
Разрабатываемые подходы не потребуют переоснащения аналитических лабораторий предприятий пищевой промышленности, органов Роспотребнадзора. Характеристики тест-систем обеспечат их высокую конкурентоспособность и возможность замены импортных аналитических средств лабораторного анализа, а также, совместно с иностранным партнером, - выход отечественных тест-систем на новые зарубежные площадки рынка.
Постер

Poster_0061F.ppt