Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0158

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0158
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Название доклада
Получение моноклонального антитела для направленной иммунотерапии аутоиммунного анкилозирующего спондилита (болезни Бехтерева)
Докладчик
Звягин Иван Владимирович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целями исследования является идентификация конcенсусной последовательности Т клеточного рецептора (ТКР), ассоциированной с патогенезом анкилозирующего спондилита (АС, болезнь Бехтерева) и получение моноклонального антитела, специфично распознающего характерный для АС ТКР для таргетной терапии. Первый этап проекта направлен на решение задачи определения консесусной структуры ТКР клонотиповТ-лимфоцитов, вовлеченных в развитие АС.
Актуальность и новизна исследования
Создание таргетных лекарственных препаратов является актуальной задачей современной молекулярной медицины. С развитием представлений об устройстве адаптивного иммунитета человека, стремительное развитие получают методы рациональной иммунотерапии – направленного вмешательства в работу иммунной системы, имеющего целью спровоцировать иммунный ответ против опухоли или инфекционного заболевания, либо скорректировать избыточный иммунный ответ в случае аутоиммунных и аллергических заболеваний.
С развитием методов диагностики и увеличением продолжительности жизни в последние десятилетия становится ясно, что аутоиммунные заболевания широко распространены в человеческой популяции. По данным американской ассоциации аутоиммунных заболеваний (AARDA), около 5% населения планеты страдает тем или иным аутоиммунным расстройством. Несмотря на то, что аутоиммунные заболевания нечасто являются непосредственной причиной смерти, их относят к социально значимым, так как нередко в результате заболевания теряется работоспособность и резко снижается качество жизни больных.
Накопленные к настоящему времени данные о молекулярно-клеточном механизме развития анкилозирующего спондилита, включая данные полученные в ходе пилотного исследования, проведенного исполнителями настоящего проекта, предполагают участие специфических Т-клеточных клонов с характерной последовательностью ТКР. Идентификация таких ТКР и создание моноклональных антител, специфически распознающих Т-клеточные клоны с несущие эти ТКР, открывает возможности для разработки таргетной терапии АС и вывода терапии АС на новый уровень.
Описание исследования

Начальный этап проекта направлен на уточнение консенсусной последовательности ТКР характеристических для АС клонов Т-клеток, характеристику встречаемости таких клонов среди больных АС и здоровых доноров, фенотипирование клеток несущих ТКР с консесусной последовательностью. Для решения поставленной задачи на первом этапе выполнения проекта были собраны образцы периферической крови больных АС, а также здоровых доноров, положительных и отрицательных по аллелю hla-B*27, одному из наиболее жестко ассоциированных с риском АС аллелей МНС. При формировании выборки пациентов учитывался тот факт, что спондилоартропатии характеризуются неодинаковой комбинацией нескольких проявлений, включающих поражения суставов осевого скелета, периферических суставов, а также внесуставными проявлениями. Подразделение диагноза АС на идиопатический (первичный) и вторичный, отражает степень выраженности признаков СпА, относящихся непосредственно к АС или к другим СпА (Molecular mechanisms of spondyloarthropathies, New York, 2009). Для снижения гетерогенности в выборку включались только пациенты с идиопатическим, т.е. классическим, вариантом анкилозириующего спондилоартрита.

Генетические факторы, в значительной степени гены MHC, оказывают существенное влияние на клональный состав Т-клеточного репертуара, что было показано как авторами данного проекта (Zvyagin I.V. et al., PNAS 2014; Putintseva E.V. et al., Front Immunol 2013), так и другими учеными (Robins H.S.et al., Sci Transl Med 2010; Ndifon W.et al., PNAS 2012; Sharon E.,et al., Nat Genetics 2016 ). Это обосновывает необходимость включения в контрольную группу здоровых доноров и hla-B*27-положительных и hla-B*27-отрицательных индивидов, для поиска и уточнения ассоциированных с АС клонотипов как по отношению к наличию заболевания, так и по специфичности к аллелю В27, жестко связанному с развитием заболевания.

Для повышения надежности ассоциации выявляемых клонотипов с АС, а также более глубокой характеристики вариабельности структуры CDR3 ТКР таких клонов, получены параллельные образцы суставной жидкости затронутого воспалением сустава и периферической крови от пациентов в стадии реактивации заболевания.

Для ряда образцов периферической крови больных АС и контрольной группы здоровых доноров, а таже для всех образцов суставной жидкости выделены отдельные фракции цитотоксических и хелперных субпопуляций Т-лимфоцитов с помощью иммуномагнитной сепарации или проточной цитометрии. Дальнейшая реконструкция клональных репертуаров каждой фракции позволит ассоциировать клонотипы с той или иной функциональной группой Т-клеток по уникальной нуклеотидной последовательности ТКР клона.

Восстановление клональных репертуаров Т-лимфоцитов в исследуемых образцах и дальнейший поиск характеристических для АС клонотипов проводится с помощью разработанной авторами проекта технологии исследования иммунорепертуаров включающей подготовку библиотек кДНК ТКР (Bolotin DA et al., Eur J Immunol, 2013; Mamedov IZ et al., Front Immunol, 2013), высокопроизводительное параллельное секвенировани полученных библиотек, и последующий анализ результатов секвенирования с помощью оригинального, разработанного авторами проекта, программного обеспечения для первичной обработки полученных данных (ПО MiGEC:, Shugay M et al., Nat Methods, 2014),  реконструкции клональных репертуаров (ПО MiTCR: Bolotin DA et al., Nat Methods, 2013) и сравнительного анализа клональных репертуаров доноров (ПО tcR: Nazarov VI et al., BMC Bioinf, 2015, и VDJtools: Shugay M et al., PLoS Comp Biol, 2015). К настоящему времени подготовлены библиотеки кДНК ТКР для всех собранных образцов клеток.

Собранная коллекция образцов периферической крови и синовиальной жидкости пациентов с АС и здоровых доноров позволит уточнить консенсусную последовательность гипервариабельной части ТКР клонов Т-клеток, вовлеченных в развитие заболевания и представляющих мишень для таргетной терапии АС.

Результаты исследования

В ходе первого этапа выполнения проекта собрана коллекция образцов периферической крови 23 больных идиопатическим АС, одного hla-B*27- пациента с АС, а также 8 здоровых hla-B*27+ доноров и 63 hla-B*27- здоровых доноров. Также для 4 пациентов с АС на стадии обострения заболевания получены параллельные образцы клеток периферической крови и синовиальной жидкости. Для ряда доноров с АС, включая всех доноров с образцами синовиальной жидкости, были выделены CD4+ и CD8+ субпопуляции Т-лимфоцитов для последующей функциональной аннотации выявленных Т-клеточных клонов.

Кроме того, для 6 hla*B27+ здоровых доноров получены образцы субпопуляции CD8+ Т-лимфоцитов несущих определенный вариабельный домен ТКР, характерный для ТКР АС-ассоциированного, по результатам предварительного анализа, консенсусного клона. Анализ клонального разнообразия данной специфической группы Т-клеток позволяет на порядок увеличить глубину анализа образцов здоровых доноров.

С помощью разработанной авторами проекта ранее оригинальной технологии пробоподготовки из всех собранных образцов клеток получены библиотеки кДНК бета-цепей ТКР полностью адаптированные для секвенирования на Illumina HiSeq 2500.

Также в соответствии с планом-графиком выполнения проекта на данном этапе проведен анализ литературных источников по теме ПНИЭР и проведен патентный поиск в соответствующей области.

Анализ клональных репертуаров восстанавливаемых по результатам секвенирования полученных библиотек позволит впервые провести глубокий анализ вариабельности ТКР идентифицированного в ходе пилотного проекта АС-специфического клона Т-лимфоцитов и сформировать консенсусную последовательность вариабельной части ТКР, что необходимо для получения специфического антитела для терапии АС.

Результатом настоящего проекта станет первая в мире специфичная мишень для терапии такого аутоиммунного заболевания, как АС– консенсус ТКР, ассоциированного с АС, и моноклональное антитело, на основе которого можно проводиться безопасная таргентая иммунотерапия АС. Очевидно, что такое моноклональное антитело имеет огромный потенциал коммерциализации на мировых рынках.

Практическая значимость исследования
Собранные в ходе первого этапа выполнения проекта образцы позволят провести сравнительный анализ клональных репертуаров Т-лимфоцитов репрезентативных выборок больных анкилозирующим спондилитом и здоровых доноров позитивных и негативных по аллелю hla-B*27, наиболее строго ассоциированному с риском развития АС генетическому фактору. Результатом такого анализа станет уточненная консесусная последовательность ТКР клонотипа Т-лимфоцитов, ассоциированного с развитием заболевания. Данная последовательность будет использована для получения моноклонального антитела для направленной терапевтической деплеции и/или функциональной блокировки клонотипов Т-клеток связанных с развитием этого заболевания, а также, возможно, ряда других hla-B*27-ассоциированных заболеваний (например, псориатического артрита). Кроме того, идентификация аутоиммунного консенсуса ТКР позволит расширить набор диагностических признаков для дифференциальной диагностики и мониторинга эффективности терапии АС.