Регистрация / Вход
Прислать материал

14.575.21.0067

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.575.21.0067
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет"
Название доклада
Получение штаммов-продуцентов сульфидов металлов из кислых отходов добычи полиметаллических руд на основе метагеномного анализа
Докладчик
Карначук Ольга Викторовна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель исследования: 1) разработка биотехнологического метода извлечения металлов из отходов горнодобывающей промышленности с использованием ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов (АСМ); 2) получение новых АСМ из кислых отходов добычи сульфидов металлов с использованием данных о метагеномах этих отходов.
Для решения цели были определены задачи:
1) поиск и выделение новых штаммов-продуцентов и/или консорциумов АСМ с использованием данных метагеномного анализа:
2) Анализ метагенома кислых местообитаний отходов добычи сульфидных руд;
3) Выделение новых АСМ, активных при низких значениях рН (не выше 2.5) и высоких концентрациях металлов;
4) Определение последовательности геномов новых АСМ и поиск механизмов устойчивости к низким рН и металлам;
5) Разработка научного задела в виде ростовых характеристик АСМ, химических и минералогических характеристик образуемых штаммами сульфидов металлов и геномной информации, который должен послужить основой для последующего создания ОКР по разработке биотехнологии извлечения металлов из отходов горнодобывающей и металлообрабатывающей промышленности и ОТР по созданию соответствующих биореакторов.
Актуальность и новизна исследования
Микроорганизмы используют как биокатализаторы при извлечении металлов из отходов горнодобывающей промышленности или бедных руд. Существенными недостатками существующих технологий биогенного осаждения металлов является использование чувствительных к металлам и низким рН смешанных культур сульфидогенов. По этой причине существующие процессы являются двухстадийными и реализуются в двух биореакторах: получение сероводорода на первой стадии и образование сульфидов металлов в химической реакции с биогенным сероводородом на второй стадии.
Получение устойчивых к металлам ацидофильных/ацидотолерантных штаммов позволит создать одностадийный однореакторный процесс, что и определяет новизну разрабатываемой биотехнологии. Введение одностадийного процесса позволит снизить себестоимость, улучшить извлечение металлов за счет прямого контакта металлов с сайтами нуклеации на клеточной стенке микроорганизмов. На основе экстремофильных сульфидогенов возможно получение сульфидов известного химического и минералогического состава вместо аморфных сульфидов переменного состава, получаемых с помощью технологии голландской компании Paques, мирового лидера в этой области.
Процесс выделения ацидофильных/ацидотолерантных изолятов представляет серьезное препятствие для разработки биотехнологий осаждения сульфидов металлов. Преимущества предлагаемого нами подхода заключаются в использовании данных метагеномного анализа при выделении штаммов-продуцентов сульфидов металлов.
Описание исследования

В качестве источника устойчивых к металлам АСМ были использованы отходы двух полисульфидных месторождений, «Бом-Горхон» и «Шерловая гора», в Забайкальском крае. Отбор проб для метагеномного анализа и выделения АСМ проводили параллельно с измерением активности сульфатредукции с Na235SO4 и измерением физико-химических параметров. Пробы воды имели низкий рН (от 2,58 до 3,6) и содержали повышенные концентрации металлов.

Для метагеномного анализа использовали пробу с максимальной концентрацией меди и других металлов. Метагеномный анализ проводили с помощью создания библиотек случайных фрагментов в соответствии с методическими рекомендациями «Rapid Library Preparation Method Manual» и геномного секвенатора GS FLX (Roche). Пиросеквенирование проведено по протоколу Titanium, приведенному в Sequencing Method Manual (ноябрь 2013).

Из проб, использованных для анализа метагенома, параллельно получали накопительные культуры АСМ. Мониторинг накопительных культур проводили методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях (ДГГЭ). Результаты ДГГЭ сравнивали с нахождением целевых филотипов в метагеноме. ДГГЭ-анализ использовался также в ходе выделения чистых культур для определения числа филотипов. Чистые культуры получали методом предельных разведений или получения отдельных колоний на твердой среде. Филогенетическое положение определяли на основе анализа последовательностей генов 16S рРНК. Для выделенных чистых культур определены возможные доноры и акцепторы электронов, пределы и оптимальные значения рН и максимальные концентрации металлов, позволяющие рост.

Для двух наиболее перспективных новых штаммов, Desulfovibrio sp. DV и Desulfosporosinus sp. BG, проведено секвенирование и анализ полных геномов. Получение последовательностей геномов позволило провести анализ механизмов устойчивости штаммов-продуцентов к металлам и низким рН среды. Для поиска родственных геномов, выравнивания и сортировки контигов использованы он-лайн сервисы BLAST, программы Mauve, r2cat и Gepard. Первоначальная автоматическая аннотация проведена с использованием пакета программ myRAST. Для поиска консервативных доменов и мотивов использовали инструмент MEGA5 и MEGA6. Метагеномный и полногеномный анализы проведены соисполнителем проекта, ФИЦ Биотехнологии РАН.

Эксперименты по культивированию АСМ  в условиях  биореактора проводили с использованием Sartorius Biostat Bplus.  Исследовано образование нерастворимых сульфидов металлов в условиях проточного культивирования в биореакторе.

Для характеристики сульфидов металлов,  образуемых в экспериментах с чистыми культурами АСМ и сульфидогенными консорциумами, использованы методы материаловедческого анализа, позволяющие выполнить комплексное описание, включая пространственную характеристику, кристаллическую структуру и элементный анализ сульфидов. Первоначально осадки сульфидов металлов собирали центрифугированием или фильтрованием по разработанным ранее в нашей группе методикам. Одновременно получены и расшифрованы дифракционные картины кристаллических сульфидов (XRD) и проведен анализ осадков с использованием сканирующей электронной микроскопии, совмещенной с энергодисперсионным  анализом (SEM-EDS). Материаловедческий анализ проводился на базе ТРЦКП при ТГУ.

Результаты исследования

Анализ метагенома отходов добычи полиметаллов на месторождении «Шерловая гора» выявил присутствие разнообразных АСМ, относящихся к родам Desulfovibrio, Desulfobacter, Desulfomicrobium, Desulfotignum, Desulfobulbus, а также фирмикутам Desulfosporosinus и Desulfotomaculum. В метагеноме обнаружены транспортеры металлов и механизмы устойчивости к низким рН. Присутствие определенных метаболических путей в метагеноме подсказало пути выделения чистых культур АСМ.

Из проб отходов добычи металлов выделены  консорциумы и 8 чистых культур АСМ. Чистые культуры  АСМ относятся к родам Desulfosporosinus и Desulfovibrio, родственные последовательности которых присутствовали в метагеноме. Штаммы росли при низких начальных значениях рН (1,5 - 3,8). Для полученных изолятов АСМ определены диапазоны рН и установлены оптимальные значения рН для роста, изучен рост в присутствии различных органических субстратов и устойчивость к ионам Cu, Cd, Co и Ni. Desulfosporosinus sp. BG был устойчив к меди (до 5 г Cu2+/л) и кадмию (до 200 мг Cd2+/л). Desulfovibrio sp. VK устойчив к ионам никеля (до 250 мгNi2+/л), Desulfovibrio spp.  DV и ED - к ионам кобальта (до 1600 и 2000 мг Co2+/л, соответственно). До сих пор рост АСМ при подобных концентрациях Cu2+ и Co2+ не был описан в литературе. Штаммы рода Desulfovibrio являются первыми ацидофильными организмами этого рода, устойчивыми к кобальту.

Секвенированы последовательности геномов новых АСМ Desulfosporosinus sp. BG и Desulfovibrio sp. DV. В геномах обнаружены транспортеры, обеспечивающие устойчивость к меди и кобальту, а также низким рН.

Рост в биореакторе чистых культур АСМ был нестабильным. Однако консорциум, состоящий из двух штаммов, Desulfosporosinus sp. NP и Desulfovibrio sp. VK, демонстрировал активный рост как в периодической культуре, так и в протоке. Изменение условий культивирования в биореакторе (концентрации меди, времени культивирования и скорости протока) позволило получать различные кристаллические сульфиды меди: халькоцит (Cu2S), ярровит (Cu9S8), кубанит (CuFeS2), халькопирит (CuFeS2), ковеллит (CuS), Образование большинства из этих форм сульфидов АСМ не было известно до наших исследований.  

Практическая значимость исследования
Проведенные работы по выделению новых АСМ - продуцентов сульфидов металлов и их генетической, физиологической и биотехнологической характеристике позволят разработать научно-технический задел для создания новых технологий получения металлов из отходов горнодобывающей промышленности. В качестве субстрата в новых технологиях могут быть использованы сточные воды предприятий по переработке цветных металлов, кислые шахтные дренажные воды, образующиеся на территории хранилищ отходов добычи сульфидных руд, отходы обогащения и пирометаллургии сульфидных руд, стоки гальванических производств и т.д.
В ходе выполнения работ по проекту подготовлены две заявки на получение патента: «Способ получения сульфидов кобальта с использованием штамма бактерии Desulfovibrio sp. ED-20 (№ 2016125634 от 28.06.2016) и «Штамм бактерии Desulfovibrio sp. VK-9 для очистки кислых сточных вод от ионов тяжелых металлов» (№ 2015151080 от 30.11.2015). Полученные РИД, а также результаты исследований по определению оптимальных условий для наиболее эффективного получения кристаллических осадков сульфидов металлов на основе использования полученных штаммов-продуцентов могут быть использованы для постановки ОКР по повторному извлечению металлов из отработанных руд.
Разработка биотехнологического метода извлечения металлов из отходов горнодобывающей промышленности на основе штаммов или консорциумов АСМ позволит: уменьшить отрицательное техногенное воздействие на окружающую среду, снизить себестоимость и улучшить извлечение металлов из вод горно-рудных отвалов, хвостохранилищ и других типов отходов. Возможно использование чистых культур АСМ для получения нано-ориентированных сульфидов переходных металлов, применяемых в качестве катализаторов в процессах гидродесульфуризации нефти, литий-О2 аккумуляторах нового поколения и топливных ячейках.