Регистрация / Вход
Прислать материал

14.613.21.0040

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.613.21.0040
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук"
Название доклада
Разработка иммуноаналитического набора для высокочувствительного внелабораторного мониторинга токсичных контаминант, основанного на применении новых нанодисперсных маркеров и амплификации сигнала
Докладчик
Дзантиев Борис Борисович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Проект направлен на создание высокочувствительных и производительных средств контроля токсичных контаминант. Результатом разработки является комплект, позволяющий проводить автономное тестирование объектов окружающей среды (природная и питьевая вода, почвы) и сельскохозяйственной продукции (молоко, мясо, продукты их переработки) и в течение не более чем 20 мин. делать вывод о наличии и природе токсичных контаминант. Специфическое выявление токсикантов осуществляется на основании формирования ими комплексов с антителами. Предлагаемый набор для тестирования включает комплект тест-полосок для проведения аналитических реакций в режиме иммунохроматографии, реагенты для экстракции и концентрирования аналитов и средства регистрации результатов.
Совместные работы консорциума Центра биотехнологии РАН и Университета ЖиангНан (г. Вукси, Китай) по разработке и апробации данного аналитического набора включали:
- характеристику иммуноаналитических реагентов, выбор их оптимальных сочетаний для высокочувствительной детекции;
- синтез конъюгатов антитело-маркер для иммунохроматографии, анализ их состава и функциональных свойств;
- разработку и апробацию новых методических решений для снижения предела обнаружения в иммунохроматографии;
- разработку режимов проведения тестирования для экспрессной характеристики контаминации объектов окружающей среды и сельскохозяйственной продукции;
- апробацию предлагаемого набора и его сопоставление с альтернативными аналитическими решениями.
Актуальность и новизна исследования
Интенсификация антропогенных воздействий на биосферу, использование в современных технологиях большого числа опасных для здоровья соединений обуславливают необходимость широкого мониторинга контаминации окружающей среды и потребительской (прежде всего – пищевой) продукции. Несмотря на значительное внимание, уделяемое этой проблеме, на сегодняшний день лишь для небольшого числа соединений контроль их наличия и сравнение с предельно допустимыми концентрациями могут осуществляться непосредственно в местах отбора проб. В большинстве же случаев доказательный анализ проводится в централизованных лабораториях с использованием дорогостоящего оборудования для высокочувствительной детекции, что снижает производительность мониторинга и оперативность принимаемых решений. Существующие средства экспресс-диагностики, такие как быстрые иммунохимические тесты, часто не обеспечивают достаточной чувствительности и не адаптированы к выявлению аналитов в больших объемах проб.
В рамках выполнения проекта обеспечена интеграция подходов, направленных на высокочувствительную иммунодетекцию и комплексный контроль контаминации во внелабораторных условиях. Обеспечение снижения пределов детекции иммунохроматограических тестов на два порядка по сравнению с традиционными методами обеспечит возможность массового тестирования контаминации, снизит расходы на контроль качества и безопасности создаваемой продукции, будет способствовать защите от негативного действия токсикантов.
Описание исследования

Взаимодействие Центра биотехнологии РАН и Университета ЖиангНан (г. Вукси, Китай) обеспечивает интеграцию в рамках проекта подходов, направленных на снижение чувствительности и трудоемкости тестирования. С этой целью при совместной реализации нового аналитического набора используются разработки российской стороны по применению в иммунохроматографии новых нанодисперсных маркеров и оригинальные решения китайской стороны по амплификации сигнала за счет образования в ходе анализа мультикомпонентных комплексов из сотен функционализированных наночастиц. Помимо этого, партнерами сформирована общая панель иммунореагентов, обеспечивающая широкий охват контролируемых контаминант.

Модульный характер реагентной комплектации реализуемых тест-систем обеспечивает возможность контроля широкого круга токсикантов с использованием единых протоколов тестирования и заменой только специфических антител. Работы по проекту включают характеристику эффективности применения набора для контроля представителей таких групп токсичных контаминант, как сульфомочевины, пиретроиды, детергенты, антибиотики, нитрофураны.

Для реализации высокочувствительных тест-систем проведена сравнительная характеристика различных наночастиц – иммуноаналитических маркеров и носителей для иммунореагентов. Получены и исследованы их комплексы с антителами разного состава. Проведена оценка пределов обнаружения маркеров в различных мембранных системах, исследована взаимосвязь этих параметров с физическими характеристиками маркеров и иммунохимическими характеристиками их конъюгатов.

Разработаны методики, обеспечивающие применение в иммунохроматографии новых нанодисперсных маркеров (квантовых точек, магнитных наночастиц); проведено их сопоставление с препаратами коллоидного золота и окрашенных латексных частиц, доминирующих в современных иммунохроматографических системах. Получены данные по влиянию состава конъюгатов наночастица–маркер на характеристики тест-систем. Изучены режимы формирования при проведении иммунохроматографии мультикомпонентных комплексов из различных функционализированных наночастиц. Исследованы возможности управления многостадийными процессами формирования детектируемых иммунных комплексов посредством изменений: 1) мембранной комплектации тест-систем, 2) геометрии нанесения реагентов и 3) состава реакционной среды. Применение магнитных наночастиц позволило концентрировать определяемые соединения из больших объемов проб.

Особенностью проекта является применение доказательных количественных методов при характеристике тест-систем и их компонентов. Выбор оптимальных сочетаний иммунореагентов осуществлялся на основании данных о кинетике и аффинности их взаимодействий, регистрируемых методами иммуноферментного и иммуносенсорного анализа. Для характеристики состава конъюгатов наночастиц и формируемых в ходе анализа комплексов на их основе применялись методы просвечивающей электронной микроскопии и регистрации динамического светорассеяния. Формирование иммунных комплексов на мембранных носителях описывалось с применением видеоцифровой регистрации, а выбор оптимального режима иммунохроматографии – на основании количественных оценок изменений пределов обнаружения и рабочих диапазонов.

Результаты исследования

Результатом работ по проекту является новый аналитический набор, представляющий собой комплект иммунохроматографических тест-систем и средств концентрирования и пробоподготовки (элюирования) и обеспечивающий проведение внелабораторного детектирования пестицидов, детергентов и антибиотиков. Набор позволяет выявлять атразин, бутахлор, хлорсульфурон, нонилфенол, 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту, бисфенол А, стрептомицин и хлорамфеникол в продуктах питания и объектах окружающей среды. Продолжительность иммунохроматографического тестирования – до 20 мин.

Проведенные исследования подтвердили эффективность предложенных подходов к снижению пределов обнаружения тест-систем. Проведено сопоставление трех подходов, позволяющих снизить предел детекции иммунохроматографических тест-систем:

- смена детектируемого нанодисперсного маркера;

- увеличение интенсивности окрашивания аналитической зоны посредством роста количества и/или размера наночастиц:

- разделение во времени специфической реакции (образования комплекса антиген-антитело) и включения маркеров в иммунный комплекс.

Экспериментально показано, что первый вариант позволяет снизить предел детекции в 20-25 раз, второй вариант – в 5-10 раз, третий – в 3-6 раз относительно стандартных тест-систем.

Показано, что квантовые точки обеспечивают наиболее чувствительное определение низкомолекулярных антигенов. Предел детекции аналита для тест-системы на основе квантовых точек в 3 раза ниже, чем в случае латексных частиц, и в 24 раза ниже, чем в случае коллоидного золота.

Подготовлены заявки на патенты по разработанным и изученным методам повышения чувствительности тест-систем.

Проведена апробация аналитического набора с использованием панели проб, совместно сформированной российскими и китайскими участниками проекта. Диагностическая чувствительность и специфичность тестирования для каждого из охарактеризованных аналитов составляли не менее 95%. Сопоставлены различные протоколы пробоподготовки, разработанные с учетом требований экспрессного внелабораторного тестирования. Подтверждена стабильность аналитических характеристик тест-систем при хранении. Подготовлены лабораторный регламент изготовления аналитического набора, инструкция по его применению, рекомендации по применению результатов проекта и их вовлечению в хозяйственный оборот, в том числе по взаимодействию с потенциальными изготовителями и потребителями аналитических наборов.

Практическая значимость исследования
Разработанный аналитический набор позволяет детектировать токсичные соединения, которые широко используются в сельском хозяйстве, производстве и ветеринарии, представляя существенную угрозу окружающей среде и здоровью человека. Попадая в воздух, воду и почву, они приводят к загрязнению среды обитания животных и человека, вызывая токсические эффекты, аллергические реакции, развитие устойчивых штаммов патогенов.
Аналитический набор предназначен для использования в работе служб агротехнического и ветеринарного контроля, санитарно-эпидемиологического контроля, в системе Роспотребнадзора, в производственных лабораториях предприятий пищевой промышленности, портативных лабораториях органов охраны окружающей среды. Его внедрение в практику обеспечит оперативное выявление контаминации и своевременное принятие мер, направленных на защиту здоровья населения и охрану окружающей среды.
Участниками проекта проведена совместная оценка возможностей масштабируемого производства предложенного аналитического набора и дальнейшего российско-китайского взаимодействия в ходе этих работ.
Предложенные методические решения по реализации высокочувствительного анализа носят универсальный характер и могут быть использованы при разработке систем детекции соединений других классов.
Постер

Poster_0040.ppt