Регистрация / Вход
Прислать материал

14.581.21.0016

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.581.21.0016
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского"
Название доклада
Разработка методов, технологий и платформ для исследований функционирования нервных систем на основе создания высокоразрешающей информационной модели кортикальных структур мозга
Докладчик
Семьянов Алексей Васильевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Цель проекта - разработка высокоразрешающей информационной модели кортикальных структур мозга, представляющей собой программный комплекс «3D Атлас нейроглии кортикальных колонок мозга крысы/мыши», способной заложить основу трансляционных исследований в области функционирования ЦНС млекопитающих, а также базу для формирования нового класса стратегических технологий – искусственных когнитивных систем.
Задачи:
1 Разработать программный комплекс «3D Атлас нейроглии кортикальных колонок мозга крысы/мыши» на основе сверхбольшого высокодоступного цифрового каталога, содержащего структурные, функциональные данные, и результаты исследований аллокации новой когнитивной информации в нейроны кортикальной колонки (выполняемых в рамках ПНИ-1).
2 Создать генноинженерные конструкции для специфического мечения астроцитов в кортикальных колонках мозга крысы/мыши.
3 Разработать методику для определения роли астроцитов в синапсе и симуляции синапса и его активности с применением ПО и алгоритмов, обеспечивающих моделирование передачи нервного импульса в сверхбольших нейроглиальных сетях (разрабатываемых в рамках ПНИ-2).
4 Разработать методику формирования трехмерной нейроглиальной культуры клеток с возможностью формирования полноценных синапсов in vitro.
5 Разработать методы исследования функционирования нервных систем на основе разработанного 3D Атласа.
Достижение целей обеспечивается использованием результатов ПНИ, выполняемых в 2015-2016 гг.:
ПНИ-1 «Разработка модели распознавания и фиксации новой информации в кортикальной микроколонке» (соглашение 14.607.21.0017)
ПНИ-2 «Разработка технологий для репрезентации функций кортикальных структур in silico» (соглашение 14.608.21.0001)

Актуальность и новизна исследования
Изучение механизмов работы мозга является в области наук о жизни одним из приоритетных направлений, представляет огромный интерес для разработки новых терапевтических стратегий для диагностики и лечения неврологических и нейродегенеративных заболеваний. Понимание фундаментальных принципов обработки информации в мозге позволяет говорить о возможностях создания новых информационных технологий, использующих принципы работы систем мозга в задачах обработки данных, управления и навигации робототехнических систем.
На сегодняшний день разработан и коммерчески доступен ряд 3D атласов головного мозга млекопитающих, однако существующие 3D атласы не позволяют рассмотреть весь спектр взаимодействий, происходящих на клеточном уровне. Ключевое внимание уделяется в основном нейронам, осуществляющим функции передачи сигналов, кодирования и декодирования информации и др. Однако в последние годы растущий интерес исследователей вызывают глиальные клетки (астроциты). Данный проект направлен на получение большого массива экспериментальных данных, их анализ и моделирование с использованием суперкомпьютерных технологий, включая использование математических моделей, описывающих взаимодействие нейронов и глии в кортикальных колонках.
В результате будет сформирована электронная база и на ее основе создан 3D атлас, описывающий взаимодействие нейронов и глии в кортикальных колонках мозга. 3D атлас будет представлять собой программный комплекс, построенный на основе высокоразрешающей модели кортикальных структур мозга. Полученные данные могут быть легко интегрированы в уже существующие международные проекты 3D атласов головного мозга и существенно увеличивать их информативность.

Описание исследования

При проведении работ на втором и третьем этапах ПНИЭР использовался комплекс междисциплинарных методов и подходов, необходимых для решения поставленных задач.

В частности, задача по определению транскрипционного профиля генной экспрессии клеток коры головного мозга проводилось с помощью данных полногеномного секвенирования технологией NGS (Illumina). Картирование 100 нуклеотидных ридов со спаренными концами, полученными на Illumina, было произведено относительно референсного генома крысы [http://rgd.mcw.edu] с использованием программы TopHat. Для оценки качественных и количественных характеристик астроцитарных генов использовали метод полуколичественной полимеразной цепной реакции (полуколичественный ПЦР). Для определения локализации экспрессируемых клетками генов применялась гибридизация insitu или FISH. 

При производстве вирусных конструктов, вошедших в состав набора реагентов для трансфекции астроцитов использовались молекулярно-биологические методики, для сборки вирусов использовалось два типа плазмид: шаттл и хелпер. Шаттл-вектор несет последовательности промотора, генов интереса и маркеров экспрессии. Хелперные плазмиды кодируют большую часть генома аденовируса. В качестве хелперной плазмиды использовалась плазмида pBHG10. Тестирование эффективности трансдукции астроцитов разработанными конструктами осуществлялось с помощью астроцитарных культур, полученных из коры больших полушарий мыши.

При исследовании структуры глиальных связей в кортикальных колонках головного мозга мыши применялось несколько методик биологического имиджинга, в том числе метод фМРТ. Была проведена оптогенетическая стимуляция астроцитов и измерение интенсивности BOLD-сигнала. Эксперименты были проведены на высокопольном магниторезонансном томографе Agilent Technologies DD2-400 9.4 T (400 MHz) с объемной вертикальной катушкой M2M (Н1). Также были проведены иммуноцитохимические и электронномикроскопические исследования срезов коры больших полушарий головного мозга мыши.

Также была разработана методика формирования трехмерной нейроглиальной культуры клеток с возможностью формирования полноценных синапсов in vitro на матриксах-носителях (скаффолдах) на основе модифицированного хитозана. Для создания трехмерных конструктов заданной архитектоники применялся метод двухфотонной полимеризации с помощью второй гармоники фемтосекундного лазера «ТЕМА-100» (Авеста проект, Россия). 

На третьем этапе выполнения проекта при проведении исследовательских испытаний экспериментального образца набора реагентов для трансфекции астроцитов in vivo вирусный препарат инъецировался в кору головного мозга. Регистрация экспрессии флуоресцентных белков проводилась при помощи мультифотонной лазерной микроскопии.

Для исследований изменений в α- и β-адренергических, пуринергических и G-белок зависимых сигнальных путях in vitro в трансфецированных генетическими конструкциями клетках были использованы первичные астроцитарные культуры. С помощью методов метода локальной фиксации потенциала и кальциевого имиджинга регистрировалась функциональная активность трансфецированных клеток при активации исследуемых каскадов.

При проведении исследовательских испытаний экспериментальных образцов трехмерных нейронглиальных культур был применен кальциевый имиджинг с применением лазерной флуоресцентной конфокальной микроскопии и окрашивания метаболически активных клеток красителем Oregon Green 488, организация синаптических контактов исследовалась с помощью методов иммуногистохимии и электронной микроскопии.

При разработке методики определения роли астроцитов в синапсе и симуляции синапса и его физиологической активности на основе существующих экспериментальных данных была предложена и исследована модель синаптического контакта с учетом воздействия астроцита. Разработанная модель тройственного синапса описывает динамику высвобождения нейропередатчика, динамику мембранного потенциала постсинаптического нейрона (на основе биофизической модели нейрона Ходжкина-Хаксли), динамику внутриклеточной концентрации Са2+ в астроците (на основе биофизической модели астроцита Уллаха) и высвобождения глиапередатчика. Исследовано два эффекта воздействия астроцита на синапс: пресинаптическое подавление высвобождения нейропередатчика  и усиление постсинаптического тока. На основе предложенной модели были изучены механизмы двунаправленной астроцитарной регуляции частоты генерации электрических сигналов нейронами в зависимости от состояния активности нейронной сети.

Результаты исследования

Работы по проекту за отчетный период выполнены полностью. В ходе выполнения работ в 2016 году (этапы 2 и 3) были получены следующие результаты:

1. Проведены исследования нейро-, глиотрансмиттерных и рецепторных транскрипционных профилей клеток кортикальных микроколонок головного мозга. Проанализировано более 60000 генов. Детально изучены гены, кодирующие нейро- и глио-трансмиттеры. Выявлено три гена, имеющие статистически значимые отличия в уровне экспрессии в стволе головного мозга и коре полушарий: Slc6a9, Slc6a11, Gabra, Gabrg1, Grm3 и Slc6a1. 

2. Проведена оценка качественных и количественных характеристик транскрипционного (экспрессионного) профиля астроцитов канонических микроколонкок коры головного мозга. Выявлены гены с высокой экспрессией; гены, экспрессия которых характерна для астроцитов; продемонстрированы отличия уровней экспрессии генов астроцитов коры в сравнении с генами астроцитов ствола мозга; охарактеризованы гены астроцитов, кодирующие белки с различной локализацией в клетке и различными функциями. 

3. Разработан и изготовлен набор реагентов для трансфекции астроцитов (ЭО НРТА) в кортикальных микроколонках головного мозга. В состав НРТА  входят 5 аденовирусных векторных конструктов для трансфекции астроцитов: AVV-sGFAP-ChR2-Venus, AVV-sGFAP-optoα1AR –YGP, AVV-sGFAP-optoβ21AR –YGP, AVV-sGFAP-Case12, AVV-sGFAP-DREADD-GFP. 

4. Исследована  с помощью биологического имиджинга (в том числе фМРТ и иммуногистохимии) и описана структура глиальных связей в кортикальных колонках мозга крысы / мыши.  Показано наличие различных астроцитарных связей в сети микроколонки – от единично расположенных клеток звездчатого типа до синцития. 

5. Разработана методика формирования трехмерной нейроглиальной культуры клеток с возможностью формирования полноценных синапсов in vitro. 

6. Получены экспериментальный образцы  трехмерной нейронглиальной культуры клеток (ЭО ТНКК) с возможностью формирования полноценных синапсов in vitro. Подтверждено формирование морфологически и функционально полноценный нейроглиальных сетей в трехмерных культурах. 

7. Разработан и согласован состав программного комплекса «3D Атлас нейроглии кортикальных колонок мозга крысы / мыши». Разработана номенклатура разработки программных компонентов комплекса «3D Атлас нейроглии кортикальных колонок мозга крысы / мыши».

8.  Разработаны программы и методики испытаний ЭО НРТА.

9.  Проведены исследовательские испытания экспериментального образца набора реагентов для трансфекции астроцитов in vivo. Продемонстрирована экспрессия соответствующих флуоресцентных белков, продемонстрированы функциональные ответы трансфецированных клеток на опто- и хемогенетическую стимуляцию.

10. Исследованы изменения в α- и β-адренергических, пуринергических и G-белок зависимых сигнальных путях in vitro в трансфецированных генетическими конструкциями клетках. 

11. Разработаны программы и методики испытаний ЭО ТНКК.

12.  Проведены исследовательские испытания ЭО ТНКК. Зарегистрирована соответствующая этапу онтогенеза культуры спонтанная кальциевая активность. 

13. Проведена оценка организации синаптического контакта в трехмерном скаффолде. С помощью иммуноцитохимического окрашивания и электронной микроскопии показано формирование зрелых синапсов в ТНКК.

14. Разработана методика определения роли астроцитов в синапсе и симуляции синапса и его физиологической активности.

Практическая значимость исследования
Область применения полученных результатов – биомедицинские исследования и разработки в области изучения мозга. Применение разрабатываемого продукта возможно как при проведении фундаментальных нейробиологических исследований, так при разработке новых терапевтических стратегий при профилактике и коррекции различных заболеваний нервной системы.
3D Атлас нейроглии кортикальных колонок мозга крысы / мыши (ЗD Атлас) предназначен для получения полных структурных (анатомических) данных, функциональных: качественных и количественных характеристик транскрипционного (экспрессионного) профиля астроцитов; данных о физиологической активности астроцитов, нейро-, глиотрансмиттерного и рецепторного профилей; данных о структуре глиальных связей в кортикальных колонках головного мозга. 3D Атлас должен позволять осуществлять симуляцию экспериментов – моделирование активирования/ингибирования астроцитарных внутриклеточных каскадов (α- и β-адренергических / пуринергических / G-белок зависимых), моделирование функционального ответа нейронов, симуляцию синапса и его физиологической активности с применением программного обеспечения и алгоритмов, обеспечивающих моделирование передачи нервного импульса в сверхбольших нейроглиальных сетях.
Разрабатываемый 3D Атлас нейроглии кортикальных колонок мозга крысы / мыши может быть использован в трансляционных исследованиях в области функционирования центральной нервной системы млекопитающих (нейробиологических, фармакологических, токсикологических и иных исследований), а также послужит базой для формирования нового класса стратегических технологий – искусственных когнитивных систем.
3D Атлас, представляя собой интерактивную базу данных о структурной и функциональной организации кортикальных колонок, будет способствовать созданию программных комплексов тестирования фармакологических воздействий на межклеточную сигнализацию в мозге. Разработка таких комплексов крайне важна для медицинских приложений и будет являться основой создания новых высокоспецифичных лекарств.