Регистрация / Вход
Прислать материал

14.616.21.0057

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.616.21.0057
Тематическое направление
Индустрия наносистем
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"
Название доклада
Разработка метода экспресс-анализа токсичности наночастиц на клеточном уровне
Докладчик
Ерофеев Александр Сергеевич
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Разработать систему эскпресс-анализа токсичности наночастиц и изучить концентрационные зависимости активных форм кислорода внутри клеток как результат воздействия магнитных наночастиц.
Основные цели проекта, направленные на повышение научно-технического и технологического комплекса страны:
— предоставление научно-исследовательским организациям новых и эффективных методов и средств проведения исследований;
— получение значимых научных результатов, позволяющих переходить к созданию новых видов научно-технической продукции;
— освоение новых методик и принципов работы, позволяющих достичь существенных результатов в дальнейшем;
— вывод на рынок новой научно-технической продукции, разработки технологий мирового уровня
Актуальность и новизна исследования
Исследования in vivo и in vitro показали, что наночастицы с различным составом (фуллерены, углеродные нанотрубки, квантовые точки) образуют активные формы кислорода. Активные формы кислорода (АФК) повреждают клетку путем пироксидирования жиров, изменения белков, разрушения ДНК, нарушения сигнальных функций и изменения транскрипции генов. Оксидативный стресс, вызванный наночастицами может иметь несколько источников - активные формы кислорода могут образовываться непосредственно на поверхности частиц, когда оксиданты и свободные радикалыприсутствуют на поверхности частиц.
Множество веществ, так или иначе оказывающихся на поверхности наночастиц, способны нанести оксидативное поражение клетке.Наночастицы из переходных металлов ( железо, медь, хром, ванадий и др.) могут вызывать образование активных форм кислорода, выступая в качестве катализаторов в реакциях фентоновского типа. Как показано в нескольких исследованиях, малые наночастицы могут проникать в митохондрии и нарушать их работу, давая вклад в окислительный стресс.
Активация воспалительных клеток, таких как альвеолярные макрофаги и нейтрофилы, которая может быть вызвана фагоцитозом наночастиц, может привести к образованию активных форм азота и кислорода.
Было показано, что наночастицы образуют гораздо большее количество свободных радикалов и активных форм, нежели большие частицы, вследствие большей общей площади поверхности.
На данный момент нет способов быстрого высокоэффективного определения АФК, по которым можно судить о токсичности наночастиц. Таким образом, разработка методов определения АФК в единичных клетках как ответная реакция на токсичность наночастиц является актуальной научно-прикладной задачей.
Описание исследования

В ходе выполнения первого этапа данного проекта были разработаны наноэлектроды с повышенной адгезией платины. Для  производства стабильных электродов перед нанесением платины создавалась полость внутри углеродного электрода, в которую электрохимически осаждалась платиновая чернь. Полость внутри наноэлектродов будет образовано путем электрохимического травления в растворе NaOH. 
Производство наноэлектродов для детекции АФК осуществлялось электрохимическим путем, что позволяет контролировать процесс всех стадий технологического процесса. Для контроля параметров электрода на каждом из этапов будут получены вольт-амперные характеристики (ВАХ) электрода в 1мМ растворе в FeMeOH, что позволит однозначно контролировать размер электродов и поверхность осаждения платины.
Испытания полученных электродов проводились в растворе с известной концентрацией перекиси водорода. Калибровка осуществлялась путем помещения электрода в физиологический буферный раствор и непрерывного измерения изменения силы тока при последовательном увеличении концентрации АФК в растворе. 
За счет средств иностранного партнера созданы современные нанозонды, в основу которых входят двойные нанокапилляры, заполненные углеродом. Огромное преимущество таких нанокапилляров заключается в том, что все каналы, заполненные углеродом, изолированы друг от друга стенкой нанокапилляра. Каждый канал, заполненный углеродом, находится на расстоянии от другого 5-10 нанометров. Это создает эффективную платформу для создания новых сенсоров, основанных на полевых транзисторах при помощи  полупроводникового соединяющего сенсорного слоя (например, графенового слоя)  между углеродными наноэлектродами. Нанозонды на основе полевых транзисторов производились при помощи электрохимического нанесения тонкого слоя восстановленного оксида графена между двумя углеродными электродами, разделенными стеклянной перегородкой.
В ходе экспериментов было  показано, что при помощи графен-пиролитического композита возможно создание полевого транзистора с высокой чувствительностью по отношению к Н2О2 с порогом детекции в 100 пМ.
Для определения внутриклеточных АФК с использованием нанозондов был разработан экспериментальный образец системы для проведения экспресс-анализа токсичности магнитных наночастиц. Экспериментальный образец включает следующие основные компоненты: оптический микроскоп для визуализации клеток, механический стол для фиксации чашки Петри с клетками и манипулятор для наноэлектрода, систему термостатирования, систему перфузии, усилитель и электронный блок считывания. Система способна детектировать токи величиной в несколько пикоампер. Основной механический модуль и вспомогательные детали спроектированы и произведены самостоятельно Исполнителем за счет использования систем автоматизированного проектирования и программируемых станков. 
Изменения уровня АФК изучены на примере клеток рака предстательной железы LNCap, клеток трансформированной эмбриональной почки HEK 293 и магнитных наночастиц. 
Такие параметры как размер, форма, поверхность магнитных наночастиц могут влиять на уровень токсичности, что должно проявляться на уровне АФК клеток. В ходе выполнения проекта рассмотрены несколько типов наночастиц. 

Синтез наночастиц осуществлялся следующими методами: сферические наночастицы размером до 10 нм получены методом соосаждения;
нанчастицы размером 10-20 нм  получены методом окислительного осаждения в водных растворах; наночастицы размером 20-40 нм будут получены методом старения; для получения кубических наночастиц использованы поверхностно-активные вещества. Для синтеза наночастиц также использован метод термического разложения ацетилацетоната железа (3). 
Для уменьшения токсичности и адресной доставки магнитных наночастиц используют функционализацию поверхности различными веществами. На втором году выполнения проекта изучено влияние покрытий магнетита на уровень АФК внутри раковых клеток. 
Определение скорости и динамики проникновения магнитных наночастиц осуществлялось за счет средств иностранного партнера. В качестве метода была выбрана сканирующая ион-проводящая микроскопия (СИМП), совмещенная с конфокальным микроскопом (КМ). 
Совмещенный СИПМ и конфокальный микроскоп (КМ) позволяют проводить одновременное измерение топографии живых клеток в среде максимально приближенной к естественной среде обитания и  осуществлять картирование маркированных веществ по поверхности и внутри живых клеток.

 

Результаты исследования

В ходе выполнения первого этапа был проведен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках исследований, в том числе обзор научных информационных источников: статьи в ведущих зарубежных научных журналах, содержащий 43 источника.

Были проведены патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96., которые выявили технический уровень и тенденции развития создания экспресс метода определения по уровню АФК токсичности наночастиц на клеточном уровне с использованием электрохимических сенсоров на основе наноэлектродов.

В ходе выполнения работ были проведены работы по исследованию и выбору наиболее эффективных способов создания Платинового зонда, были проведены теоретические исследования путей создания метода и системы для проведения экспресс-анализа токсичности магнитных наночастиц по внутриклеточному уровню активных форм кислорода.

В ходе выполнения первого этапа были проведены работы по 3D моделированию экспериментального образца Системы в современных САПР системах, что позволило значительно упростить и повысить качество производства Системы.

С помощью современного ЧПУ оборудования был разработан и изготовлен экспериментальный образец Системы по разработанным ранее 3D моделям и эскизной конструкторской документации.

В ходе выполнения работ была разработана методика изготовления экспериментальных образцов Платиновых зондов. Были разработаны и изготовлены экспериментальные образцы Платиновых зондов.

В ходе выполнения работ были разработаны Методика калибровки Платиновых зондов по перекиси водорода, а также Методика калибровки Платиновых зондов по супероксиду калия. Были разработана программа и методики испытаний экспериментальных образцов Платиновых зондов. Были разработаны  программа и методики испытаний экспериментального образца Системы.

В ходе выполнения работ были проведены исследовательские испытания экспериментальных образцов Платиновых зондов по разработанной Программе и методике исследовательских испытаний, объекты испытаний успешно прошли испытания. Было разработано технико-экономическое обоснование разработки продукции.

За счет средств иностранного партнера были проведены работы по исследованию и выбору наиболее эффективных способов создания Графенового зонда, была проведена разработка методики изготовления экспериментальных образцов Графеновых зондов, были проведены разработка  и изготовление экспериментального образца Графенового зонда. Иностранным партнером была произведена разработка методики калибровки экспериментальных образцов Графеновых зондов. Были разработаны  программы и методики испытаний экспериментальных образцов Графеновых зондов. Были проведены исследовательские испытания экспериментальных образцов Графеновых зондов по разработанной Программе и методике исследовательских испытаний, которые успешно прошли разработанные Графеновые зонды.

Разработанные и изготовленные Платиновые зонды и экспериментальный образец Системы, разработанные на химическом факультете МГУ, использовались для внутриклеточного определения АФК на втором этапе выполнения работ. Была проведена серия экспериментов на различных наночастицах и клеточных культурах по определению АФК как показателя токсичности. 

Практическая значимость исследования
Мировые исследования in vivo и in vitro показали, что наночастицы с различным составом (фуллерены, углеродные нанотрубки, квантовые точки) образуют активные формы кислорода. На данный момент нет способов быстрого высокоэффективного определения АФК, по которым можно судить о токсичности наночастиц. Таким образом, разработка методов определения АФК в единичных клетках как ответная реакция на токсичность наночастиц является актуальной научно-прикладной задачей, на решение которой были направлены работы в рамках Соглашения.
Постер

Poster_2016+.ppt