Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0096

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0096
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"
Название доклада
Получение и иммунохимическое исследование рекомбинантных антител-кандидатов для комплексной профилактики и терапии заболеваний, вызванных вирусом Эбола
Докладчик
Долгих Дмитрий Александрович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Проект направлен на решение проблемы получения рекомбинантных антител для пассивной иммунотерапии геморрагической лихорадки Эбола.

Цель проекта - получение, исследование и отбор моноклональных антител против вирусного гликопротеина для создания на их основе рекомбинантных антител как потенциальных компонентов нового комбинированного терапевтического средства борьбы с лихорадкой Эбола.

Задачи исследования:
1. Получение в результате иммунизации мышей рекомбинантным гликопротеином вируса Эбола гибридом - продуцентов моноклональных антител.
2. Получение и характеризация в терминах аффинности и кросс-реактивности представительного набора моноклональных
антител против компонентов вирусного капсида.
3. Проведение отбора не менее трех моноклональных антител, специфичных к неперекрывающимся эпитопам вирусного гликопротеина.
4. Выделение генов вариабельных доменов кандидатных моноклональных антител анти- Эбола, конструирование генов
рекомбинантных антител анти-Эбола и системы их экспрессии.
5. Получение клеточных линий СНО - продуцентов рекомбинантных антител анти-Эбола.
6. Осуществление биосинтеза, выделение и очистка экспериментальных образцов рекомбинантных антител анти-Эбола.
7. Проведение иммунохимической характеризации рекомбинантных антител анти-Эбола в сравнении с коммерческими аналогами.
Актуальность и новизна исследования
Использование специфичных вируснаправленных рекомбинантных антител является на данный момент одним из наиболее перспективных экспериментально подтвержденных способов превентивной профилактики и терапии геморрагической лихорадки, вызванной вирусом Эбола. Использование терапевтических (химерных, гуманизированных) антител позволяет активизировать иммунную систему и непосредственно устранить патогенетический фактор заболевания - вирусные частицы. Пассивная иммунизация рекомбинантными антителами позволяет добиться терапевтического эффекта при введении через 24 ч после инфицирования. Многочисленные данные свидетельствуют, что комбинация антител, специфичных к различным эпитопам, обладает значительно более выраженным терапевтическим эффектом по сравнению с монотерапией. Сформированный в результате предварительных испытаний препарат ZMapp обеспечил 100%-ную выживаемость у всех подопытных животных, при том, что до введения препарата у многих отмечались серьезные проявления заболевания. Ни один из использовавшихся ранее препаратов не позволял достичь подобного уровня выживаемости. Несмотря на то, что препарат ZMapp до сих пор не прошел клинических испытаний и не был одобрен в качестве терапевтического средства, он был применен для лечения людей, инфицированных вирусом Эбола во время эпидемии 2014 г. в Западной Африке. Пять из семи пациентов были успешно излечены.

Настоящее исследование направлено на поиск новой возможно более эффективной комбинации терапевтических антител для превентивной и пост-инфекционной терапии геморрагической лихорадки Эбола.
Описание исследования

Для иммунизации мышей линии Balb/c использовали гликопротеин вирусной оболочки GP без трансмембранного домена (EBOV rGPdTM) с теоретической молекулярной массой ~ 68 кДа, экспрессированный в клетках насекомых Sf9. Для иммунизации мышей линии Balb/c использовали конъюгат EBOV rGPdTM и белка теплового шока HSP65 из M. tuberculosis. Тестирование супернатантов гибридом проводили методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием биотинилированного EBOV rGPdTM. Отбор антител-кандидатов проводили на основании результатов иммунохимического анализа выделенных из асцитной жидкости образцов моноклональных антител IgG- и IgM-изотипов. Использовали даннные иммуноблоттинга с рекомбинантным гликозилированным и дегликозилированным EBOV rGPdTM, а также твердофазного сэндвич-ИФА, позволявшего проанализировать эпитопную специфичность полученных моноклональных антител.

Для отобранных антител проводили выделение и определение нуклеотидной последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей. Для этого использовали метод обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции на основе суммарной РНК из клеток гибридом. Сравнение последовательностей с базами данных иммуноглобулинов IMGT (www.imgt.org) подтвердило их принадлежность к генам иммуноглобулинов мыши и позволило определить наиболее родственные зародышевые линии. Для подтверждения правильности определения первичной структуры вариабельных доменов антител использовали метод пептидного масс-фингерпринта. Анализ молекулярной массы пептидных продуктов гидролиза исследуемых антител подтвердил правильность установленных аминокислотных последовательностей вариабельных доменов легких и тяжелых цепей.

На основе вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей были сконструированы гены полноразмерных химерных антител IgG1-каппа изотипа. Полученные ДНК клонировали в специально сконструированный бипромоторный экспрессионный вектор, предназначенный для ускоренной селекции стабильных клеточных линий СНО-продуцентов рекомбинантных антител. Для отбора клонов-продуцентов была использована технология отбора, основанная на последовательном повторяющемся использовании селективного давления метотрексатом, флуоресцентного клеточного сортинга и роботизированной системы высокоточного отбора клонов-суперпродуцентов Clone PIX FL. Отобранные клоны-продуценты были исследованы на жизнеспособность и продуктивность при культивировании в жидкой среде. Для увеличения выхода рекомбинантных антител анти-Эбола была проведена адаптация клонов-продуцентов к условиям выращивания в суспензии в бессывороточной среде. Проведена наработка, выделение и очистка 3-х полноразмерных рекомбинантных антител анти-Эбола.

Проведена иммунохимическая характеризация рекомбинантных полноразмерных антител анти-Эбола.  Для доказательства подлинности рекомбинантных антител проводили иммуноблоттинг с моноклональными антителами, специфичными к характеристическим участкам тяжелой и легкой цепей. Для выяснения специфичности трех экспериментальных образцов рекомбинантных химерных Fab-фрагментов против вирусного гликопротеина использовали метод иммуноблоттинга с рекомбинантным EBOV rGPdTM. Также для этого проводили непрямой ИФА с иммобилизованными рекомбинантными белками вируса Эбола: гликопротеина EBOV rGPdTM , нуклеопротеина NP и структурного белка VP40.   Определены константы диссоциации комплекса антиген-антитело. Принимая во внимание, что иммунореактивность рекомбинантных химерных антител по отношению к иммобилизованному и находящемуся в растворе EBOV rGPdTM может различаться, также была изучена иммунореактивность антител с биотинилированным EBOV rGPdTM в растворе. Для эпитопного картирования рекомбинантных антител был использован метод конкурентного ИФА с биотинилированным EBOV rGPdTM и рядом коммерческих антител против вирусного гликопротеина, входящими в состав известных "антительных коктейлей" MB-003 и ZMapp. Были использованы антитела с известными эпитопами -  гуманизированное нейтрализующее h13F6 , химерное нейтрализующее c13C6FR1, химерное нейтрализующее c6D8, полностью человеческое нейтрализующее KZ52. Для каждого из полученных в данной работе рекомбинантных антител были рассчитаны коэффициенты ингибирования с каждым из коммерческих антител, что позволило произвести оценку эпитопной специфичности исследуемых антител. Полученные данные подтвердили, что каждое из полученных антител имеет индивидуальную эпитопную специфичность.

 

Результаты исследования

1. Проведена иммунизация мышей линии Balb/c иммуноконъюгатом рекомбинантного белка G вируса Эбола с белком теплового шока HSP65. В результате проведения селекции, скрининга и клонирования новых мышиных гибридом были отобраны 5 гибридом, проведено изотипирование культуральных супернатантов. Для проведения детального иммунохимического анализа и отбора антител-кандидатов были отобраны 3 гибридомы, продуцирующие антитела IgM изотипа, и 2 – IgG изотипа.

2. Осуществлены выделение и очистка всех антител из асцитной жидкости методами аффинной хроматографии на белок G- сефарозе (антитела GPE118 и GPE534 IgG-изотипа) и преципитации эуглобулинов (антитела GPE274, GPE325 и GPE463 IgM-изотипа).

3. Для отбора антител-кандидатов исследовано связывание полученных антител с рекомбинантным гликопротеином вируса Эбола в растворе и при его иммобилизации. Для подтверждения специфичности новой панели антител также использовали метод иммуноблоттинга, по данным которого все моноклональные антитела интенсивно взаимодействуют с полноразмерным гликопротеином. При этом ряд антител взаимодействуют с минорными фрагментами гликопротеина, что подтверждает их направленность к разным эпитопам. По результатам иммуноблоттинга и сэндвич-ИФА отобраны 3 антитела-кандидата для создания терапевтического коктейля. Значения констант диссоциации отобранных антител находятся в диапазоне 0.8 -1.8 нМ, что подтверждает их высокую аффинность к вирусному гликопротеину.

4. Из суммарной РНК клеток гибридом методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции проведено выделение и клонирование кДНК вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей антител-кандидатов. Установленная аминокислотная последовательность подтверждена методом масс-спектрометрии. Все полученные антитела являются уникальными.

5. Проведено конструирование системы экспрессии полноразмерных рекомбинантных антител. В результате селекции получены клеточные линии СНО - продуценты исследуемых антител. Осуществлен биосинтез рекомбинантных антител в бессывороточной среде. В результате проведения процедур выделения и очистки получены экспериментальные образцы рекомбинантных антител анти-Эбола.

6. Изучены иммунохимические свойства антител-кандидатов методами иммуноблоттинга, а также непрямого и конкурентного ИФА с использованием различных рекомбинантных белков вируса Эбола. Доказана подлинность рекомбинантных химерных Fab-фрагментов, а также их специфичность по отношению к рекомбинантному гликопротеину. Результаты непрямого ИФА свидетельствуют об отсутствии перекрестного иммунологического взаимодействия с белками NP и VP40 вируса Эбола. Исследована эпитопная специфичность полученных рекомбинантных антител с использованием панели коммерческих нейтрализующих антител. Установлено, что все исследуемые антитела направлены против разных участков гликопротеина. При этом эпитопы рекомбинантных химерных антител  совпадают или частично перекрываются с эпитопами трех коммерческих нейтрализующих антител против вируса Эбола.

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности проведения исследования разработанных рекомбинантных антител, потенциальных компонентов терапевтического коктейля, на клеточных и животных моделях.

 

Практическая значимость исследования
Эпидемия геморрагической лихорадки Эбола представляет серъезную угрозу всему мировому сообществу. Возникновение эпидемии в 2014 г. свидетельствует о том, что эпидемии геморрагической лихорадки Эбола могут иметь в дальнейшем рецидивирующий характер. В связи с данным обстоятельством представляется жизненно необходимым формирование наряду со средствами вакцинации национального резерва терапевтических средств для борьбы с последствиями заражения вирусом Эбола, а также индустриальных возможностей, позволяющих в короткие сроки увеличить производство инъекционных форм рекомбинантных терапевтических средств на основе моноклональных антител.