14.607.21.0096

Проект направлен на решение проблемы получения рекомбинантных антител для пассивной иммунотерапии геморрагической лихорадки Эбола.

Цель проекта - получение, исследование и отбор моноклональных антител против вирусного гликопротеина для создания на их основе рекомбинантных антител как потенциальных компонентов нового комбинированного терапевтического средства борьбы с лихорадкой Эбола.

Задачи исследования:
1. Получение в результате иммунизации мышей рекомбинантным гликопротеином вируса Эбола гибридом - продуцентов моноклональных антител.
2. Получение и характеризация в терминах аффинности и кросс-реактивности представительного набора моноклональных
антител против компонентов вирусного капсида.
3. Проведение отбора не менее трех моноклональных антител, специфичных к неперекрывающимся эпитопам вирусного гликопротеина.
4. Выделение генов вариабельных доменов кандидатных моноклональных антител анти- Эбола, конструирование генов
рекомбинантных антител анти-Эбола и системы их экспрессии.
5. Получение клеточных линий СНО - продуцентов рекомбинантных антител анти-Эбола.
6. Осуществление биосинтеза, выделение и очистка экспериментальных образцов рекомбинантных антител анти-Эбола.
7. Проведение иммунохимической характеризации рекомбинантных антител анти-Эбола в сравнении с коммерческими аналогами.

Использование специфичных вируснаправленных рекомбинантных антител является на данный момент одним из наиболее перспективных экспериментально подтвержденных способов превентивной профилактики и терапии геморрагической лихорадки, вызванной вирусом Эбола. Использование терапевтических (химерных, гуманизированных) антител позволяет активизировать иммунную систему и непосредственно устранить патогенетический фактор заболевания - вирусные частицы. Пассивная иммунизация рекомбинантными антителами позволяет добиться терапевтического эффекта при введении через 24 ч после инфицирования. Многочисленные данные свидетельствуют, что комбинация антител, специфичных к различным эпитопам, обладает значительно более выраженным терапевтическим эффектом по сравнению с монотерапией. Сформированный в результате предварительных испытаний препарат ZMapp обеспечил 100%-ную выживаемость у всех подопытных животных, при том, что до введения препарата у многих отмечались серьезные проявления заболевания. Ни один из использовавшихся ранее препаратов не позволял достичь подобного уровня выживаемости. Несмотря на то, что препарат ZMapp до сих пор не прошел клинических испытаний и не был одобрен в качестве терапевтического средства, он был применен для лечения людей, инфицированных вирусом Эбола во время эпидемии 2014 г. в Западной Африке. Пять из семи пациентов были успешно излечены.

Настоящее исследование направлено на поиск новой возможно более эффективной комбинации терапевтических антител для превентивной и пост-инфекционной терапии геморрагической лихорадки Эбола.

Для иммунизации мышей линии Balb/c использовали гликопротеин вирусной оболочки GP без трансмембранного домена (EBOV rGPdTM) с теоретической молекулярной массой ~ 68 кДа, экспрессированный в клетках насекомых Sf9. Для иммунизации мышей линии Balb/c использовали конъюгат EBOV rGPdTM и белка теплового шока HSP65 из M. tuberculosis. Тестирование супернатантов гибридом проводили методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием биотинилированного EBOV rGPdTM. Отбор антител-кандидатов проводили на основании результатов иммунохимического анализа выделенных из асцитной жидкости образцов моноклональных антител IgG- и IgM-изотипов. Использовали даннные иммуноблоттинга с рекомбинантным гликозилированным и дегликозилированным EBOV rGPdTM, а также твердофазного сэндвич-ИФА, позволявшего проанализировать эпитопную специфичность полученных моноклональных антител.

Для отобранных антител проводили выделение и определение нуклеотидной последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей. Для этого использовали метод обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции на основе суммарной РНК из клеток гибридом. Сравнение последовательностей с базами данных иммуноглобулинов IMGT (www.imgt.org) подтвердило их принадлежность к генам иммуноглобулинов мыши и позволило определить наиболее родственные зародышевые линии. Для подтверждения правильности определения первичной структуры вариабельных доменов антител использовали метод пептидного масс-фингерпринта. Анализ молекулярной массы пептидных продуктов гидролиза исследуемых антител подтвердил правильность установленных аминокислотных последовательностей вариабельных доменов легких и тяжелых цепей.

На основе вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей были сконструированы гены полноразмерных химерных антител IgG1-каппа изотипа. Полученные ДНК клонировали в специально сконструированный бипромоторный экспрессионный вектор, предназначенный для ускоренной селекции стабильных клеточных линий СНО-продуцентов рекомбинантных антител. Для отбора клонов-продуцентов была использована технология отбора, основанная на последовательном повторяющемся использовании селективного давления метотрексатом, флуоресцентного клеточного сортинга и роботизированной системы высокоточного отбора клонов-суперпродуцентов Clone PIX FL. Отобранные клоны-продуценты были исследованы на жизнеспособность и продуктивность при культивировании в жидкой среде. Для увеличения выхода рекомбинантных антител анти-Эбола была проведена адаптация клонов-продуцентов к условиям выращивания в суспензии в бессывороточной среде. Проведена наработка, выделение и очистка 3-х полноразмерных рекомбинантных антител анти-Эбола.

Проведена иммунохимическая характеризация рекомбинантных полноразмерных антител анти-Эбола.  Для доказательства подлинности рекомбинантных антител проводили иммуноблоттинг с моноклональными антителами, специфичными к характеристическим участкам тяжелой и легкой цепей. Для выяснения специфичности трех экспериментальных образцов рекомбинантных химерных Fab-фрагментов против вирусного гликопротеина использовали метод иммуноблоттинга с рекомбинантным EBOV rGPdTM. Также для этого проводили непрямой ИФА с иммобилизованными рекомбинантными белками вируса Эбола: гликопротеина EBOV rGPdTM , нуклеопротеина NP и структурного белка VP40.   Определены константы диссоциации комплекса антиген-антитело. Принимая во внимание, что иммунореактивность рекомбинантных химерных антител по отношению к иммобилизованному и находящемуся в растворе EBOV rGPdTM может различаться, также была изучена иммунореактивность антител с биотинилированным EBOV rGPdTM в растворе. Для эпитопного картирования рекомбинантных антител был использован метод конкурентного ИФА с биотинилированным EBOV rGPdTM и рядом коммерческих антител против вирусного гликопротеина, входящими в состав известных "антительных коктейлей" MB-003 и ZMapp. Были использованы антитела с известными эпитопами -  гуманизированное нейтрализующее h13F6 , химерное нейтрализующее c13C6FR1, химерное нейтрализующее c6D8, полностью человеческое нейтрализующее KZ52. Для каждого из полученных в данной работе рекомбинантных антител были рассчитаны коэффициенты ингибирования с каждым из коммерческих антител, что позволило произвести оценку эпитопной специфичности исследуемых антител. Полученные данные подтвердили, что каждое из полученных антител имеет индивидуальную эпитопную специфичность.

 

1. Проведена иммунизация мышей линии Balb/c иммуноконъюгатом рекомбинантного белка G вируса Эбола с белком теплового шока HSP65. В результате проведения селекции, скрининга и клонирования новых мышиных гибридом были отобраны 5 гибридом, проведено изотипирование культуральных супернатантов. Для проведения детального иммунохимического анализа и отбора антител-кандидатов были отобраны 3 гибридомы, продуцирующие антитела IgM изотипа, и 2 – IgG изотипа.

2. Осуществлены выделение и очистка всех антител из асцитной жидкости методами аффинной хроматографии на белок G- сефарозе (антитела GPE118 и GPE534 IgG-изотипа) и преципитации эуглобулинов (антитела GPE274, GPE325 и GPE463 IgM-изотипа).

3. Для отбора антител-кандидатов исследовано связывание полученных антител с рекомбинантным гликопротеином вируса Эбола в растворе и при его иммобилизации. Для подтверждения специфичности новой панели антител также использовали метод иммуноблоттинга, по данным которого все моноклональные антитела интенсивно взаимодействуют с полноразмерным гликопротеином. При этом ряд антител взаимодействуют с минорными фрагментами гликопротеина, что подтверждает их направленность к разным эпитопам. По результатам иммуноблоттинга и сэндвич-ИФА отобраны 3 антитела-кандидата для создания терапевтического коктейля. Значения констант диссоциации отобранных антител находятся в диапазоне 0.8 -1.8 нМ, что подтверждает их высокую аффинность к вирусному гликопротеину.

4. Из суммарной РНК клеток гибридом методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции проведено выделение и клонирование кДНК вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей антител-кандидатов. Установленная аминокислотная последовательность подтверждена методом масс-спектрометрии. Все полученные антитела являются уникальными.

5. Проведено конструирование системы экспрессии полноразмерных рекомбинантных антител. В результате селекции получены клеточные линии СНО - продуценты исследуемых антител. Осуществлен биосинтез рекомбинантных антител в бессывороточной среде. В результате проведения процедур выделения и очистки получены экспериментальные образцы рекомбинантных антител анти-Эбола.

6. Изучены иммунохимические свойства антител-кандидатов методами иммуноблоттинга, а также непрямого и конкурентного ИФА с использованием различных рекомбинантных белков вируса Эбола. Доказана подлинность рекомбинантных химерных Fab-фрагментов, а также их специфичность по отношению к рекомбинантному гликопротеину. Результаты непрямого ИФА свидетельствуют об отсутствии перекрестного иммунологического взаимодействия с белками NP и VP40 вируса Эбола. Исследована эпитопная специфичность полученных рекомбинантных антител с использованием панели коммерческих нейтрализующих антител. Установлено, что все исследуемые антитела направлены против разных участков гликопротеина. При этом эпитопы рекомбинантных химерных антител  совпадают или частично перекрываются с эпитопами трех коммерческих нейтрализующих антител против вируса Эбола.

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности проведения исследования разработанных рекомбинантных антител, потенциальных компонентов терапевтического коктейля, на клеточных и животных моделях.

 

Эпидемия геморрагической лихорадки Эбола представляет серъезную угрозу всему мировому сообществу. Возникновение эпидемии в 2014 г. свидетельствует о том, что эпидемии геморрагической лихорадки Эбола могут иметь в дальнейшем рецидивирующий характер. В связи с данным обстоятельством представляется жизненно необходимым формирование наряду со средствами вакцинации национального резерва терапевтических средств для борьбы с последствиями заражения вирусом Эбола, а также индустриальных возможностей, позволяющих в короткие сроки увеличить производство инъекционных форм рекомбинантных терапевтических средств на основе моноклональных антител.