Регистрация / Вход
Прислать материал

14.579.21.0022

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.579.21.0022
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства
Название доклада
Разработка конъюгированных вакцин на основе синтетических углеводных лигандов против возбудителей госпитальных инфекций
Докладчик
Симбирцев Андрей Семенович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Целью прикладного научного исследования является разработка конъюгированных вакцинных препаратов на основе рекомбинантного белка-носителя CRM197 и синтетических спейсерированных углеводных лигандов, структурно родственных альгинату бактерии Pseudomonas aeruginosa и общему полисахаридному антигену клеточной стенки патогенных грибов – прототипов вакцин для лечения госпитальных бактериальных и грибковых инфекций.
Результаты работы будут использованы для проведения доклинического исследования разработанных вакцинных препаратов и разработки технологии производства конъюгированных вакцин.
Актуальность и новизна исследования
Проект направлен на разработку конъюгированных вакцинных препаратов нового поколения против бактериальных (Pseudomonas aeruginosa) и грибковых (Candida albicans, Aspergillus fumigatus и др.) патогенов.
Выбор патогенов обусловлен тем, что они являются одними из наиболее распространенных возбудителей госпитальных инфекций и проявляют высокую антибиотикорезистентность.
В настоящее время весьма сложно оценить частоту и этиологическую структуру госпитальных инфекций в России из-за отсутствия официальной регистрации данных заболеваний.
Переход на новое поколение вакцин, основанных на использовании синтетических олигосахаридных лигандов строго определённого строения и содержащих в зафиксированном положении спейсерную группу, позволяющую проводить конъюгацию с белками-носителями разных типов специфично, контролируемо и воспроизводимо, как требует производство по стандартам GMP, позволит разработать новые методы получения конъюгированных вакцинных препаратов.
Описание исследования

Разрабатываемые конъюгированные вакцинные препараты на основе рекомбинантного белка-носителя CRM197 и синтетических спейсерированных углеводных лигандов предназначены для лечения и профилактики госпитальных бактериальных (Pseudomonas aeruginosa) и грибковых (Candida albicans, Aspergillus fumigatus и др.) инфекций.

Компоненты для получения конъюгированных вакцинных препаратов -   бета-(1→4)-олигоманнуронозиды должны соответствовать следующим требованиям:

- строго соответствовать по своей структуре фрагментам бактериального альгината;

- структура должна быть подтверждена данными спектров ядерного магнитного резонанса (ЯМР) на ядрах 1Н и 13С и масс-спектрометрии высокого разрешения;

- чистота должна быть не менее 95% по данным спектров 1Н ЯМР.

 Компоненты для получения конъюгированных вакцинных препаратов - бета -(1→3)-олигоглюкозиды должны соответствовать следующим требованиям:

- должны строго соответствовать по своей структуре фрагментам грибкового   бета -(1→3)-глюкана;

- структура должна быть подтверждена данными спектров ядерного магнитного резонанса (ЯМР) на ядрах 1Н и 13С и масс-спектрометрии высокого разрешения;

- чистота должна быть не менее 95% по данным спектров 1Н ЯМР.

Компонент для получения конъюгированных вакцинных препаратов - рекомбинантный белок CRM197 должен быть получен в количестве не менее 200 мг и должен соответствовать следующим требованиям по чистоте:

- содержание белка штамма-продуцента, определенное методом иммуноферментного анализа (ИФА) - не более 0,2 нг/мкг белка;

- содержание ДНК штамма-продуцента, определенное методом молекулярной гибридизации - не более 2 пг/мкг белка;

содержание бактериальных эндотоксинов - не более 10,0 ЕЭ на 1,0 мг белка.

Экспериментальные образцы конъюгированной вакцины против P. aeruginosa  должны соответствовать следующим требованиям:

- содержать в среднем не менее 4-х углеводных лигандов
на молекулу белка по данным масс-спектрометрии MALDI-TOF;

- индуцировать образование IgG антител, специфичных фрагментам бактериального альгината, в экспериментах на животных;

титр специфических IgG антител в иммунных сыворотках должен не менее чем в 2 раза превышать титр антител в сыворотках неиммунизированных животных;

опсонизирующая активность иммунных сывороток должна превышать активность сывороток неиммунизированных животных не менее чем на 15%.

Экспериментальные образцы конъюгированной вакцины против грибов Candida и Aspergillus должны соответствовать следующим требованиям:

- содержать в среднем не менее 4-х углеводных лигандов
на молекулу белка по данным масс-спектрометрии MALDI-TOF;

- индуцировать образование IgG антител, специфичных фрагментам грибкового бета -(1→3)-глюкана, в экспериментах на животных;

- титр специфических IgG антител в иммунных сыворотках должен не менее чем в 2 раза превышать титр антител в сыворотках неиммунизированных животных;

- опсонизирующая активность иммунных сывороток должна превышать активность сывороток неиммунизированных животных не менее чем на 15%.

Результаты исследования

Подготовлен аналитический обзор информационных источников.

Выполнены патентные исследования по ГОСТ Р 15.011-96, подана заявка на изобретение «Способ избирательного удаления О-ацетильных защитных групп в присутствии О-бензоильных» № 2015135165 от 19.08.2015 г.

Выполнена оценка генетической стабильности штамма E.coli - продуцента белка CRM197.

Изучены культуральные свойства штамма-продуцента белка CRM197 на основе клеток E.coli, проведена оптимизация процесса культивирования штамма-продуцента белка CRM197.

Разработаны - метод синтеза спейсерированных бета-(1→3)-олигоглюкозидов различной длины, включающих 3, 5 и 7 моносахаридных звеньев; методы синтеза спейсерированных бета-(1→3)-олигоглюкозидов различной длины, включающих 9, 11 и 13 моносахаридных звеньев, и спейсерированных бета-(1→4)-олигоманнуронозидов различной длины, включающих 3, 5 и 7 моносахаридных звеньев.

Разработаны метод очистки рекомбинантного белка CRM197 из клеток штамма-продуцента  E.coli BL21 и рефолдинга белка с использованием ионообменной, гидрофобной и молекулярно-ситовой хроматографии и метод определения подлинности рекомбинантного белка CRM197 с помощью косвенного неконкурентного метода ИФА.

Получен рекомбинантный белок CRM197 и изучены его физико-химические свойства;

осуществлен контроль его качества.

Разработан метод синтеза покрывающих антигенов с использованием иммуноферментного анализа для двух типов покрывающих антигенов — конъюгатов олигосахаридных лигандов с бычьим сывороточным альбумином и с биотином.

Разработаны - метод конъюгирования CRM197 с синтетическими олигосахаридными лигандами для создания вакцинных препаратов; лабораторные регламенты получения конъюгированных вакцин на основе синтетических олигосахаридных лигандов и белка-носителя CRM197 - ЛР 00479741-089-16 и ЛР 00479741-090-16.

Разработаны Программа и методики исследовательских испытаний, методы контроля качества экспериментальных образцов конъюгированных вакцин; различные варианты лекарственной формы конъюгированных вакцин (раствор для инъекций, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций).

Выполнена иммунизация лабораторных животных экспериментальными образцами конъюгированных вакцин, получены иммунные сыворотки; изучена иммуногенная активность экспериментальных образцов конъюгированных вакцин путем определения в иммунных сыворотках титров иммуноглобулинов IgG, IgM и IgG-субизотипов; определена опсонизирующая активность иммунных сывороток, полученных при иммунизации экспериментальными образцами конъюгированных вакцин и оценено влияние длины углеводного лиганда на иммунологические свойства конъюгированных вакцин.

Разработан проект технического задания на проведение ОТР.

Разработаны рекомендации по использованию результатов ПНИ в реальном секторе экономики; обобщены полученные результаты исследований; разработано технико-экономического обоснование разработки продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера.

Выполнены - оценка РИД; формирование технических требований и предложений по разработке, производству и эксплуатации продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера; маркетинговые исследования с целью изучения перспектив коммерциализации РИД, полученных при выполнении ПНИ.

Изучена стабильность разработанных лекарственных форм конъюгированных вакцин.

Практическая значимость исследования
Результаты проекта предполагается использовать для доклинического исследования вакцинных препаратов и разработки технологии производства конъюгированных вакцин. По результатам доклинических исследований будут отобраны кандидаты конъюгированных вакцин для последующих клинических исследований.
Разрабатываемые конъюгированные вакцинные препараты могут быть использованы для организации производства и медицинского применения на территории Российской Федерации.
За счет снижения стоимости препарата в сравнении с зарубежными аналогами ожидается улучшение лекарственного обеспечения, повышение качества оказания медицинской помощи и улучшение результатов лечения больных бактериальными и грибковыми госпитальными инфекционными заболеваниями, а также повышение их качества жизни.
Экономический эффект применения конъюгированных вакцинных препаратов предполагает сокращение сроков пребывания пациентов в стационаре, снижение уровня смертности от бактериальных и грибковых госпитальных инфекций и повышение качества жизни населения.
Планируемым непосредственным потребителем ожидаемых результатов является индустриальный партнер – одна из ведущих российских высокотехнологичных фармацевтических компаний –АО «Р-Фарм» (r-pharm.com). Кроме того, потребителями научно-технических результатов будут являться учреждения, непосредственно использующие вакцины против госпитальных инфекций – больницы, медицинские клиники. Предполагаемый рынок сбыта – региональный и всероссийский, возможно значительное расширение присутствия на традиционных внешних рынках.