Регистрация / Вход
Прислать материал

14.576.21.0045

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.576.21.0045
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Общество с ограниченной ответственностью "ИБМХ - ЭкоБиоФарм"
Название доклада
Разработка электрохимических сенсорных систем на основе полимеров с молекулярными отпечатками для анализа белков-кардиомаркеров
Докладчик
Шумянцева Виктория Васильевна
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Разработка научно-технического задела и стратегии в создании биораспознающих материалов – аналогов антител, как сенсорных элементов в высокочувствительном анализе функционально-значимых белков. Разработка основных принципов и методов анализа биоаффинных взаимодействий биораспознающих реагентов с белками-мишенями с целью использования в биосенсорном анализе. Создание мультиплексных сенсоров для определения концентрации белков в биообразцах за счет взаимодействия целевых белков с биораспознающими материалами – аналогами антител.
Задачей исследования является разработка электрохимической сенсорной системы для определения концентрации кардиомиоглобина в плазме крови за счет взаимодействия с биораспознающим материалом на основе молекулярно импринтированного полимера, конъюгированного с углеродными нанотрубками, для ранней диагностики острого инфаркта миокарда.
Технология молекулярного импринтинга в биосенсорном анализе была использована в качестве альтернативы природным аффинным реагентами антителам для анализа белка-кардиомаркера миоглобина. Разработан метод электроанализа миоглобина как маркёра острого инфаркта миокарда с помощью графитовых электродов, модифицированных молекулярно импринтированным полимером на основе орто-фенилендиамина на поверхности многостеночных углеродных нанотрубок. С помощью анализа электрохимических параметров проведена 2D-классификация образцов плазмы крови, позволяющая валидировать плазму крови, и отнести образцы к зоне риска или к зоне здоровья

Актуальность и новизна исследования
Проблема ранней диагностики соматических, психических и психосоматических заболеваний является актуальной для медицины, для профилактики заболеваний, для точного выбора методов и средств лечения. Анализ и количественное определение белков – маркеров заболеваний требует создания высокоселективных сенсоров. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются одной из основных проблем Российского и международного здравоохранения. ССЗ представляют реальную угрозу здоровью и сокращают продолжительность жизни человека. В связи с этим проблема разработки и создания аналитических тест-систем на основе анализа специфических белков – маркеров для ранней диагностики инфаркта миокарда (ИМ) – является своевременной. Увеличение концентрации миоглобина является критерием острой фазы ИМ. Для регистрации миоглобина применяются различные подходы с использованием методов масс-спектрометрии, жидкостной хроматографии, колориметрии, плазмонного поверхностного резонанса, электроанализа. Биораспознающим элементом, как правило, являются антитела, специфичные к миоглобину. Технология молекулярного импринтинга в биосенсорном анализе – альтернатива природным аффинным реагентам. Разработаны методы электросинтеза молекулярно импринтированных полимеров (МИП) на основе о-фенилендиамина в качестве аффинного реагента для анализа миоглобина. Такой способ позволяет получать аффинную матрицу на сенсорном элементе – электроде, что позволяет стандартизировать процедуру. Для повышения чувствительности анализа разработан метод, основанный на конъюгировании МИП с углеродными многостеночными нанотрубками (УНТ).
Описание исследования

Электрохимические исследования проводились с помощью потенциостата AUTOLAB 12 («Metrohm Autolab», Нидерланды), снабженного программным обеспечением GPES (версия 4.9.7).Микрогравиметрический анализ с мониторингом диссипации проводили в проточной ячейке с помощью кварцевого кристаллического резонатора (QCM-D, quartz crystal microbalance with dissipation monitoring Q-Sense E1), интегрированного с потенциостатом-гальваностатом IPC Compact.

Полимерные аналоги антител на основе молекулярно импринтированных полимеров получали методом электрополимеризации. Для повышения чувствительности анализа проводили конъюгирование полученных молекулярно импринтированных полимеров с углеродными нанотрубками. Регистрация взаимодействия кардиомаркера миоглобина с полученными полимерными аналогами антител проводилась с помощью электрохимического анализа (циклическая вольтамперометрия, катодная квадратно-волновая вольтамперометрия, катодная дифференциально-импульсная вольтамперометрия). Была проведена оценка электрохимической константы диссоциации в системе МИП на основе о-фенилендиамина и МИП/УНТ с  миоглобином.

Схема.1. Полимерные матрицы с молекулярной памятью в качестве аффинных сорбентов для электроанализа миоглобина как кардиомаркера острого инфаркта миокарда.

Результаты исследования

Для разработки электрохимических сенсорных систем на основе МИП в качестве мономера использовали о-фенилендиамин (1,2-диамино-бензол, ФДА). Электрополимеризацию ФДА проводили методом циклической вольтамперометрии в водных буферных растворах, что удобно для получения МИП с целью анализа белковых молекул. Используя метод микрогравиметрии с мониторингом диссипации было показано, что при электрополимеризации на поверхности рабочего электрода, в качестве которого использовали кварцевый резонатор с золотым напылением (с диаметром рабочей поверхности 14 мм), наблюдается значительный прирост массы пленки по мере увеличения числа циклов. Контрольная система (не содержащая темплатных молекул миоглобина, немолекулярно импринтированный полимер, НИП) показала меньший прирост массы пленки. Это указывает на успешное встраивание темплатных молекул в пленку и формирование МИП, происходящее при полимеризации ФДА в присутствии миоглобина. Оптимизация процесса электрополимеризации позволила найти отношение ФДА/миоглобин, равное 10 : 1, при котором наблюдается максимальное различие масс пленок МИП/НИП = 5, которое использовали в дальнейшем для анализа связывания миоглобина с МИП и оценки распознавательной способности полимера по отношению к миоглобину. С целью увеличения чувствительности полученных биосенсоров для электроанализа миоглобина проводилась конъюгация МИП с многостеночными углеродными нанотрубками (УНТ). Миоглобин регистрировали по пику восстановления Fe3+ гемопротеина в диапазоне потенциалов от –0.4 до –0.6 В методом катодной квадратно-волновой или дифференциально-импульсной вольтамперометрии. Анализ в присутствии кислорода позволяет регистрировать электрокаталитические свойства миоглобина как металлопротеина, что приводит к усилению сигнала сенсора. Восстановительные потенциалы миоглобина при встраивании в УНТ/МИП и МИП близки: E = –0.48 ± 0.06 В и Е = –0.44 ± 0.08 В, соответственно. . Кинетика связывания миоглобина представлена кривой насыщения (R2 = 0.94). Области линейной зависимости лежат в диапазонах 1 × 10–11 – 5 × 10–10 М и 5 × 10–10 – 5 × 10–8 М. Сравнительная чувствительность полученных сенсорных систем составила 2×10-4 А/нмоль в случае системы МИП/миоглобин и 1,5×10-2 А/нмоль для системы с конъюгированными УНТ (УНТ/МИП). Равновесная константа диссоциации Кд = (2.4±0.5) 10–8 М для МИП/электродов, и (9.8 ± 2.6) 10–11 М для УНТ/МИП электродов. Разработан новый подход к удалению белковой молекулы-шаблона миоглобина для получения полимера с полостями для анализируемого миоглобина. Для анализа проб с помощью электродов, модифицированных МИП, были собраны образцы плазмы крови здоровых доноров и больных ОИМ. На основе анализа двух электрохимических параметров: интенсивности восстановительного пика и площади восстановительного пика миоглобина, регистрируемой методом дифференциальной импульсной вольтамперометрии УНТ/МИП электродов, проведена 2D-классификация плазм здоровых доноров и пациентов с ОИМ. В результате обработки электрохимических параметров получены два кластера: здоровые доноры (1) и больные ОИМ (2). Такая классификация позволяет более точно отнести образцы к «зоне риска». Кроме того, были проанализированы образцы плазмы крови здоровых добровольцев, концентрация миоглобина в которых была неизвестна. Используя 2D классификацию, такие образцы относятся к «зоне здоровья».

Практическая значимость исследования
Так как МИП-электроды имеют аналитические характеристики, сопоставимые с электродами, модифицированными антителами, возможно использование искусственных аналогов антител (МИП) для регистрации миоглобина в плазме крови здоровых доноров и больных инфарктом миокарда. Таким образом, полученные МИП сенсоры, обладая достаточной специфичностью, могут быть использованы для анализа плазмы крови больных ОИМ. Их более высокая конкурентоспособность по сравнению с иммуносенсорами обусловлена простотой изготовления и значительно более низкой стоимостью. Преимуществом разработанных нами МИП сенсоров является возможность прямой электрохимической регистрации миоглобина с помощью метода катодной квадратно-волновой или дифференциально-импульсной вольтамперометрии по интенсивности пика восстановления гемопротеина. Конъюгация МИП с углеродными наноматериалами, такими как углеродные нанотрубки значительно повышает чувствительность электроанализа миоглобина.
Электроанализ является одним из наиболее чувствительных методов при разработке сенсорных систем медицинского назначения. Необходимо отметить, что разработаны как аналитические приборы потенциостаты/гальваностаты для научных исследований (фирмы MetrohmAutolab, Ivium, Нидерланды,); так и портативные микропотенциостаты для работы в «полевых» условиях» (фирма Dropsens, www.dropsens.com)