Регистрация / Вход
Прислать материал

14.607.21.0062

Аннотация скачать
Постер скачать
Общие сведения
Номер
14.607.21.0062
Тематическое направление
Науки о жизни
Исполнитель проекта
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Название доклада
Создание терапевтических бифункциональных агентов на основе одноцепочечных антител для элиминации раковых стволовых клеток и предотвращения рецидивов опухолей
Докладчик
Чумаков Степан Петрович
Тезисы доклада
Цели и задачи исследования
Испытание новых подходов, направленных на комплексное воздействие на популяцию раковых стволовых клеток, с целью разработки перспективного класса терапевтических препаратов, предотвращающих развитие рецидивов злокачественных новообразований. Создание серии бифункциональных терапевтических агентов на основе одноцепочечных миниантител, обладающих повышенной специфичностью, биодоступностью, высокоэффективно и избирательно поражающих раковые стволовые клетки, более дешевых по сравнению с традиционными моноклональными антителами. Проведение испытаний полученных бифункциональных терапевтических агентов, получение новых сведений об особенностях метаболизма, локализации и развития лекарственной устойчивости раковых стволовых клеток, для разработки новых, еще более эффективных терапевтических подходов.
Актуальность и новизна исследования
Существующие подходы к противораковой терапии с использованием моноклональных антител обладают рядом недостатков: высокая стоимость производства, низкая эффективность получения работающих клонов антител, связанная с необходимостью скрининга сотен и тысяч клонов с последующей селекцией вариантов, а также их большой размер, ограничивающий способность проникать в различные ткани, что понижает эффективность действия антител в отношении раковых стволовых клеток. При создании бифункциональных агентов использован новый подход, основанный на применении мини-антител, лишенных легкой цепи, т.н. VHH (variable heavy-heavy), встречающихся у млекопитающих семейства верблюжьих. VHH-антитела отличаются высокой аффинностью к своим лигандам, миниатюрностью, что позволяет проникать в большинство тканей, и высокой стабильностью, обеспечивающей способность успешно усваиваться даже из кишечника. scFv-фрагменты VHH- антител могут быть эффективно экспрессированы в бактериальных клетках-продуцентах, что позволит существенно снизить стоимость производства терапевтического препарата на их основе. Сочетание этих качеств дает возможность добиться получения бифункционального агента, обладающего меньшим размером, а значит большей биодоступностью, чем моноклональное антитело против одной мишени, большей специфичностью действия при меньшей стоимости производства. Другой элемент научной новизны исследования заключается в том, что три из четырех предложенных мишеней (CD47, CD44 и HER2/neu) для создания бифункциональных агентов могут выступать как в качестве маркера, определяющего специфичность разрабатываемого терапевтического средства, так и в качестве эффектора противораковой терапии.
Описание исследования

Основная задача исследования связана с созданием серии бифункциональных агентов, основанных на высокоаффинных фрагментах одноцепочечных антител, избирательно поражающих раковые стволовые клетки опухолей молочной железы, и разработкой на их основе противоопухолевого препарата. Основными мишенями для создания специфичных антител – составных частей бифункциональных агентов – являются поверхностные молекулы, экспрессия которых характерна для стволовых клеток опухолей молочной железы: рецепторы CD47, CD44, HER2/Neu и Notch1. Поиск и селекция одноцепочечных антител, обладающих необходимыми свойствами, проводилась при помощи паннинга фаговых библиотек фрагментов антител, а также постановки рибосомного дисплея. Для обоих подходов необходимо наличие иммунной библиотеки фрагментов антител, полученных от животного семейства верблюжьих (в нашем случае альпак), иммунизированного соответствующим антигеном, и введенных в состав либо фагмиды, либо РНК-конструкции для рибосомного дисплея. Для иммунизации животных требуется значительное количество антигена, с корректной вторичной структурой и паттернами гликозилирования, в связи с чем. было осуществлено получение эукариотических культур клеток – продуцентов растворимых форм антигенов CD44, СD47, Notch1 и HER2/neu, очистка антигенов из клеточных сред при помощи аффинной и ионообменной хроматографии и проведение иммунизации альпак. После иммунизации был произведен забор генетического материала (периферических В-лимфоцитов) путем резекции периферического лимфоузла и последующего выделения из него цельной фракции полиаденилированной РНК. Полученная РНК была использована для создания фаговой и РНК-библиотек фрагментов для постановки фагового и рибосомного дисплеев, in vitro селекции и обогащения библиотек наиболее аффинными фрагментами VHH-антител. Параллельно проведено изготовление наивной библиотеки фрагментов VHH-антител из генетического материала альпак, полученного из костного мозга неонатального животного. В результате раундов паннинга из каждой библиотеки отобрано не менее 10 наиболее частых фрагментов вариабельных участков антител. Отобранные фрагменты антител были протестированы на панели линиий клеток рака молочной железы (всего 45 линий): проведена оценка специфичности связывания фрагментов антител с рецептором мишенью и отсутствия нежелательной кросс-реакций с прочими поверхностными белками методом проточной цитометрии с использованием флуоресценто-меченых антител на эпитоп Myc, введенным в состав тестируемых фрагментов антител. Функциональная активность фрагментов антител была оценена по их способности подавлять рост фракций раковых стволовых клеток (РСК) ex vivo – в клеточных культурах, и in vivo – в бестимусных мышах с привитыми РСК. Для фрагментов антител на CD47 оценена их способность блокировать взаимодействие клеточного CD47 РСК с растворимым рекомбинантным флуоресцентно-меченым SIRPa, а также ex vivo оценен уровень фагоцитоза путем добавления очищенной культуры макрофагов. Параллельно проведены опыты на РСК неоплазий кроветворной системы, в частности, культур клеток острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) и материале, полученном от пациентов. В результате функциональных испытаний отобраны фрагменты антител, наиболее специфично взаимодействующие с рецепторами-мишенями и вызывающие максимальное подавление пролиферации и/или активацию фагоцитоза обработанных РСК. Далее был осуществлен поиск оптимальной пары фрагментов VHH-антител для создания биспецифичного противоопухолевого агента, обладающего наиболее выраженным действием в отношении РСК. Для этого определена оптимальная длина пептидного линкера, соединяющего фрагменты одноцепочечных антител и обеспечивающего одновременный контакт биспецифичного агента с обоими поверхностными рецепторами. Исследование было проведено с использованием наиболее аффинных вариантов фрагментов антител на CD44, CD47, HER2/neu и Notch1 в различных комбинациях. После определения оптимальной структуры линкера, с его использованием составлен набор из всех вариантов фрагментов антител на каждый рецептор-мишень, которые прошли функциональные тесты. Полученные биспецифичные агенты протестированы на способность избирательно подавлять рост РСК ex vivo, а затем in vivo, на мышиной модели с привитыми РСК из клеточных культур и из резекционного материала. Для опредленных в ходе опытов биспецифичных агентов, обладающих максимальной эффективностью и избирательностью действия определен диапазон эффективных дозировок, измерена биодоступность в различных тканях и уровни токсичности. 

Результаты исследования

В ходе исследований получены клеточные линии-продуценты белков СD47, CD44, HER2/neu и Notch1, из которых выделены растворимые формы антигенов и проведена иммунизация четырех альпак. После забора у альпак генетического материала, содержащего периферические В-лимфоциты, из него получена мРНК и созданы библиотеки вариабельных частей антител альпак, на основе которых были созданы фаговые и РНК-библиотеки, обогащеннные аффинными фрагментами VHH-антител за счет раундов in vitro селекции с помощью фагового и рибосомного дисплеев (для антигенов CD47, CD44, ERBB2 и NOTCH1 отобрано по 5 вариантов антител с лучшей аффинностью и специфичностью). Фрагменты VHH антител экспрессированы в виде растворимых форм с myc-tag, подвергнуты очистке и протестированы на способность связываться с мишенью in vitro и in vivo на панели клеточных линий рака молочной железы. Большинство из отобранных VHH продемонстрировали специфическое связывание. Для проверки эффективности их онкосупрессорного действия на субпопуляцию РСК опухолей молочной железы, из клеточной линии MDA-MB-231 были выделены фракции CD44+ CD24- ALDH+ клеток и протестированы на уровень туморогенности на бестимусных мышах, а также на способность подавлять рост РСК in vitro. Обнаружено, что 3 из 5 клонов анти-CD47 VHH и 1 из 5 клонов анти-CD44 VHH обладают такой активностью, кроме того, 4 из 5 клонов анти-ERBB2 антител оказывали супрессирующее действие в отношении HER2-положительных РСК. Аналогичные результаты были in vivo на бестимусных мышах с привитыми РСК. Далее проведена оценка терапевтического потенциала фрагментов одноцепочечных антител против опухолевых рецепторов на раковых стволовых клеток острого миелоидного лейкоза (ОМЛ). Установлено, что анти-CD44 и анти-CD47 антитела оказывают существенное ингибирующее влияние на рост РСК ОМЛ, превосходящее ингибирующий эффект в отношении РСК рака молочной железы (РМЖ). С целью идентификации потенциальных новых молекулярных мишеней для терапии ОМЛ было проведено дифференциальное секвенирование транскриптомов РСК-плюс и РСК-минус фракций клеточных линий ОМЛ. На фракциях РСК РМЖ из первичных культур опухолевых клеток, полученных из резекционного материала был также зафиксирован стойкий ингибирующий эффект в случае применения анти-ERBB2 и анти-CD44 антител и умеренный эффект от применения анти-CD47 антител. Проведен поиск оптимальной пары фрагментов антител с целью создания эффективного терапевтического бифункционального агента, для чего создана серия экспрессирующих конструкций с различными вариантами спаренных фрагментов, соединенных пептидными линкерами различной длины. Оценено влияние фрагментов антител в составе потенциального бифункционального агента, определена длина линкера, сводящего к минимуму стерические взаимодействия фрагментов антител. На основе полученных результатов созданы бифункциональные агенты в различных комбинациях вариантов фрагментов антител на CD44, CD47, HER2/neu и Notch1, протестированы на способность избирательно подавлять рост раковых стволовых клеток ex vivo, in vivo, на мышиной модели с привитыми РСК, а также на резекционном материале пациенток, после чего отобраны обладающие наибольшим терапевтическим потенциалом и подготовлены к проведению дальнейших клинических исследований. Все полученные результаты обладают научной ценностью, новизной и являются конкурентноспособными по сравнению с аналогичными работами мирового уровня.

Практическая значимость исследования
Медицинское применение бифункциональных агентов, направленных на подавление РСК, в сочетании с традиционными терапевтическими средствами позволит улучшить средний прогноз пяти- и дестятилетней выживаемости пациентов, перенесших рак молочной железы, и, в конечном счете, снизить уровни смертности населения от одного из самых распространенных видов рака.
Полученные в ходе разработки терапевтических агентов данные о взаимодействии противораковых антител и раковых стволовых клеток, а также о влиянии анти-РСК терапии на метаболизм РСК позволят в дальнейшем определить и разработать новые подходы к протиопухолевой терапии, обладающие еще более высокой избирательностью и эффективностью. Результаты проекта – данные о представленности РСК в общей популяции клеток опухоли молочной железы в зависимости от типа опухоли, уровнях туморогенности РСК и степени их устойчивости к противораковой терапии могут послужить основой для разработки новых, более точных прогностических критериев течения того или иного подтипа рака молочной железы, оценки вероятности развития рецидива, необходимости проведения дополнительных раундов химиотерапии, и, в конечном счете, также внесут вклад в создание более эффективных терапевтических схем.
Результаты, связанные с опытом использования фрагментов VHH-антител для проведения противораковой терапии могут быть в дальнейшем применены для создания новых терапевтических препаратов, основанных на антителах этого класса. Уникальные свойства, характерные для антител исключительно этого вида, могут привести к внедрению препаратов, основанных на антителах в таких областях терапии, где это ранее было невозможно ввиду особенностей структуры и свойств традиционных моноклональных антител.
Постер

14.607.21.0062.ppt